正文 第二節藥用植物的多倍體育種(2 / 3)

胚乳培養(endospermculture)是指將胚乳從母體上分離出來,放在無菌的人工環境條件下,讓其進一步生長發育,以至形成幼苗的過程。胚乳培養很早就引起了人們的重視,主要是它在理論研究和實踐上都有重要價值,如可以了解胚乳的全能性,了解胚和胚乳的相互關係,還可以從培養的胚乳細胞中獲得無子結實的三倍體植株,進而可將它加倍成六倍體植株,這在育種上有一定意義。

被子植物的胚囊結構大部分物種為蓼形胚囊,蓼形胚囊具有2個極核;而貝母形、皮耐亞形、磯鬆形和小磯鬆形具有4個極核,它們的胚乳應是五倍體;而有些其他胚囊類型的植株的胚乳植株的染色體倍性就更高了,表明不同類型胚乳培養獲得多種多倍體類型胚乳植株的可能性。

2.胚乳培養的三倍體育種技術

胚乳培養的三倍體育種的程序分為擬下幾個步驟:胚乳植株的誘導→胚乳植株的再生→胚乳植株的移栽→胚乳植株的染色體鑒別。

(1)胚乳植株誘導的基本過程

①取材和培養胚乳外植體製備很簡單。對於有大塊胚乳組織的植物種子來說(如大戟科和檀香科),可將種子直接作表麵滅菌,無菌水衝洗幹淨後,在無菌條件下除去種子的表皮即可培養。對於某些植物,如桑寄生科植物,其胚乳被一些黏性流質層包圍,取出胚乳很不方便,這時先將整個種子作表麵滅菌後,在無菌條件下剝開種皮,去掉黏性流質層,取出胚乳組織。對於具有果實的種子,如槲寄生[Viscumcoloratum(Kom.)Nakai]的植株,製備成熟胚乳時,取授粉後幾天的幼果,用70%乙醇表麵消毒數秒鍾,再用飽和漂白粉滅菌10~20min,用無菌水衝洗3~4次。在無菌條件下切開幼果,取出種子,小心分離出胚乳,接種在培養基上培養。注意剝離胚乳時不能帶有任何胚組織,稍有疏忽就有可能造成胚乳愈傷組織中混有胚來源的愈傷組織。培養溫度25~27℃,黑暗或散射光下培養。

②培養結果胚乳接種到培養基中6~10d後,胚乳外觀顯得膨大而光滑,往往在切口處形成乳白色的隆突,並不斷增殖成團塊,且不斷增多。少數胚乳外植體的這種突起可以轉為綠色,形成葉狀叢(例如獼猴桃),但大多數植物胚乳外植體上的隆突再行增殖成新的團塊,成為典型的愈傷組織。這時,應及時轉到分化培養基上培養,否則愈傷組織會停止生長,直至老化死亡。

(2)胚乳植株的再生通過愈傷組織的再分化,把正在旺盛生長的愈傷組織及時進行分化培養。分化培養需供給充足的光照,培養一段時間後即可看到從愈傷組織處分化出芽。有些胚乳植株可直接由胚狀體或不定芽形成,有些胚乳植株需將不定芽移至生根培養基上進行生根培養,才能長成完整植株。在貼進愈傷組織處切下不定芽,插入生根培養基中,光下培養10~15d後,就會在切口處長出白色的根。

(3)胚乳植株的移栽通常是先將根係發育正常的試管苗,去掉瓶塞,在光下放2天,再取出洗去瓊脂,浸入營養液中15~30min,然後移植在肥土︰沙(4︰1)的土中,放在25~30℃的弱光下,待植株長出新葉後,即可移至大田。

(4)胚乳植株的染色體鑒別取出植株的根尖、幼葉或胚乳愈傷組織,采用根莖壓片法進行染色體鑒別。

(二)應用組織培養技術培育多倍體

應用組織培養技術培育多倍體是組織培養技術發展的一個新的技術,它是組織培養技術與秋水仙堿誘導技術的有機結合。

1.應用組織培養技術培育多倍體的原理

應用組織培養技術進行多倍體育種是基於秋水仙堿的誘導作用而建立起來的。秋水仙堿(colchicine)是從百合科(Liliaceae)植物秋水仙種子、球莖中提取出來的一種植物堿,分子式為C22H25O6N。秋水仙堿呈白色或黃色粉末或針狀結晶,有劇毒,易溶於冷水、乙醇和氯仿,難溶於熱水、乙醚等,有效誘導濃度為0.0006~16%,一般以0.2%濃度效果最好。常被用作多倍體誘導劑,經秋水仙堿處理後的種子或幼苗細胞染色體數會發生加倍。其誘導加倍的機製與微管、著絲粒的結構和特性有關,主要是秋水仙堿具有幹擾微管裝配,破壞紡錘體形成和終止細胞分裂的作用。細胞分裂是從核開始的,核內染色體正在分裂,而整個細胞還沒有開始分裂時,外界條件發生劇烈變化,造成細胞質分裂暫時終止,抑製紡錘絲的形成,核內的染色體則照常進行複製,但不能拉向兩極,使全部子染色體包括在同一細胞中,當外界條件影響消失後,細胞再繼續分裂時,核內的染色體己增加了1倍,形成了多倍性細胞。

組織培養中把秋水仙堿加入培養基,對叢生芽或愈傷組織進行誘變,可以做到劑量穩定可靠,方法簡便易行,誘變處理時間長,因此誘變效果好,誘導變異類型多,選擇餘地大。同時,組織培養條件下誘變後的植株,用試管苗進行根尖染色體鑒定比在田間誘變後挖取根部逐株鑒定簡便得多,可以在短期內快速鑒定大批量株係,從而篩選出多倍體。最後,經顯微鑒定確認的多倍體植株,可以立即應用組織培養技術在短期內迅速繁殖出數以十萬株以上試管苗,進行田間鑒定、生產試驗和示範推廣,而且繁殖出來的種苗純度高、質量好,沒有蟲害,這對提高藥材產量和質量十分有利。

秋水仙堿的誘變作用隻在細胞分裂時期,對於那些處於靜止狀態的細胞沒有作用,因此所處理的植物組織必須是分裂最活躍、最旺盛的部分,通常是處理萌動的或剛發芽的種子、幼苗、嫩枝的生長點、芽及花蕾等,對於那些發芽慢的幹燥種子效果往往不佳。

2.應用組織培養進行多倍體育種的基本技術

染色體加倍實驗的離體材料一般選用愈傷組織、胚狀體、莖尖組織、葉片、子房和原生質體作材料。組織分化再生能力較強的植物,誘導染色體加倍以後用愈傷組織或胚狀體為材料較好。因為愈傷組織的細胞可以分散,秋水仙堿處理可以提高染色體加倍的效率,還可以減少嵌合現象。

根據秋水仙堿處理的材料不同,可將此技術分為兩種:一種是通過芽的處理進行四倍體的誘導;另一種是通過愈傷組織的處理進行多倍體的誘導。

(1)應用處理芽技術培育多倍體的基本技術分為以下幾個步驟:不定芽的誘導→芽的增殖培養→壯苗培養→多倍體誘導→芽的培養→染色體檢測。

①不定芽誘導的基本過程(以百合為例)

主要材料植物的各種組織、器官。培養穩定25±2℃,光照強度800~1200lx,每天照射9~14h。

不定芽誘導的具體過程a.取材:取蘭州百合、川百合的鱗片為外植體。b.消毒:在無菌條件下,將鱗片經70%乙醇消毒處理30s,再投入到0.1%升汞溶液中浸泡10min,再用無菌水衝洗3~5次。c.培養:將消毒好的材料切成0.5cm小塊,接種於MS附加1mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的培養基中培養。d.培養結果:兩種百合在培養基中培養15~30d後,皆能在切口基部誘導出1~5個白色的小突起,繼續培養數天後,小突起分化成乳白色或淡綠色的叢生芽。

②芽的增殖培養切割不定芽轉入MS附加1mg/L6-BA和0.5mg/LNAA中培養,不定芽在增殖培養基中培養30d後,在其基部又產生3~8個叢生芽。切割叢生芽轉入壯苗培養基中培養,30~40d後形成小鱗莖,再切割小鱗莖,轉入增殖培養基中培養15~30d,在其基部又萌生3~5個叢生芽。如此反複培養,就能達到快速繁殖的目的。

③壯苗培養切割叢生芽,轉人MS附加0.5mg/LNAA和9%蔗糖和0.4%藥用炭的培養基上培養。叢生芽轉入生根壯苗培養中培養15d後,在其切口基部形成3~5條白色的根係,繼續培養15~20d後,形成綠色小鱗莖。小鱗莖可直接移栽到大田中。

④多倍體誘導可采用浸泡方式和藥棉處理兩種方法進行:

浸泡方式在無菌條件下,將幼小叢生芽浸入含0.1%秋水仙堿濃度下處理2~4d或0.25%秋水仙堿淺層溶液的培養瓶中處理1~3d,再轉入增殖培養基中培養。

藥棉處理方法將浸透0.1%秋水仙堿溶液的脫脂棉,經高壓滅菌後,嵌在已轉入增殖培養基上的叢生芽上,處理2~3d後逐日取出藥棉,使秋水仙堿溶液滲透叢生芽生長點。