(1)機械攪拌式生物反應器這類生物反應器混合程度高,適應性廣,在大規模生產中廣泛使用。攪拌罐中產生的剪切力大,容易損傷細胞,直接影響細胞的生長和代謝,特別對於次級產物的生成影響極大。攪拌轉速越高,產生剪切力越大,對植物細胞傷害越大。傳統的機械攪拌罐不適合培養某些對剪切力敏感的植物細胞。
(2)非攪拌式生物反應器相對於傳統攪拌式生物反應器來說,非攪拌式生物反應器所產生的剪切力較小,結構簡單,因此被認為適合植物細胞培養。其主要類型有鼓泡式反應器、氣升式反應器和轉鼓式反應器等。由於鼓泡式反應器對氧的利用率較低,如果用較大通氣量,則產生的剪切力會損傷細胞。氣升式反應器(圖5-1)適用於多種植物細胞懸浮培養或固定化細胞培養,它由一個兩頭封閉的圓柱形筒和小內筒組成。當壓縮空氣從筒體底部通入時,氣流帶動培養液由內筒下部向上移動,再經過內筒上端流入內外筒夾層中,往下流動,又從底部進入內筒,如此往返循環,達到攪動細胞和補充氧氣的目的。此裝置的優點是切變低,混合好,不易汙染,是目前較好的一種反應器。但其操作彈性較小,低氣速時,尤其H/D大,高密度培養時,混合性能欠佳。過量供氣,過高的氧濃度反而會影響細胞的生長和次生代謝產物的合成。將氣升式發酵罐與慢速攪拌結合使用可彌補低氣速時混合性差的弱點。
圖5-1氣升式反應器示意圖
在植物細胞培養過程中,抑製細胞生長和損傷細胞的主要是剪切力,而不是氧供應不足,相反,過高的氧濃度往往抑製細胞生長和產物合成。提高混合程度和降低剪切力,是目前設計適於植物細胞培養反應器的主要原則,但如果能提高植物細胞對剪切力的耐受程度,將大大簡化反應器的選擇和設計問題。在很多情況下,剪切力抑製產物的合成,但對生長影響不大。另外,對於需要光照的細胞,還要考慮光源的設置、光傳遞及光的產熱問題。不同植物細胞的特性,如對剪切力的耐受性、結團情況、倍增時間、對氧和光的需求等各不相同,沒有任何反應器能滿足所有植物細胞培養的要求,實驗中應根據細胞特性采用合適的反應器。
2.固定細胞培養法
固定細胞培養法(fixedcellprocess)是將生物催化劑(植物細胞或原生質體)經吸附、共價連鎖或囊束而固定在基質上或基質內的培養方法。植物細胞固定化一般采取凝膠包埋、膜固定、網格和泡沫固定和表麵吸附等。最適用的方法是把大的敏感的植物細胞和原生質體囊束於多糖或多聚化合物(如聚丙烯)製成的網狀支持物中進行無菌培養,基質可向固定化細胞擴散,產物可從固定化細胞排出。固定化植物細胞培養,減少了剪切力對細胞的損失,有利於次級代謝產物的合成和分泌代謝產物的分離。用於植物細胞培養的固定化係統主要有填充反應器、流化床和膜反應器和3種。
(1)填充床生物反應器細胞和基質填充在一個有玻璃夾套的罐內,底部不斷的通入濕空氣(圖5-2)。細胞可以位於支撐物表麵,也可包埋於支撐物之中,培養液流經支撐物顆粒,不斷被細胞利用。優點:單位體積固定細胞量大。缺點:混合效果低,對必要的氧傳遞、pH、溫度控製和氣體產物的排除造成困難,影響細胞的培養。
圖5-2填充床生物反應器
(2)流化床生物反應器利用液體的能量來懸浮顆粒。顆粒呈流化狀態所需的能量與顆粒大小成正比,因此常采用小固定化顆粒,這些小顆粒良好的傳質特性是流化床反應器的優點,缺點:剪切力和顆粒碰撞會損壞固定化細胞。
(3)膜生物反應器采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細胞。營養物質通過膜滲透到細胞中,細胞產生的次級代謝產物通過膜釋放到培養液中。主要有:中空纖維反應器和螺線式卷繞反應器,優點:可以重複使用。
二、影響細胞培養物中次生代謝產物生產的因素
用細胞培養進行有效成分生產,已引起人們廣泛興趣。但多數實驗結果表明,細胞培養物成分的含量常低於原植物組織中的含量,有的甚至不含有原有植物所含的有效成分,如罌粟的培養細胞中未檢測出嗎啡類衍生物。這是細胞培養工業化生產有用產物的嚴重障礙,急需研究克服。其原因是多方麵的,有內在的因素,也有外在的因素,比較複雜。以下幾點是重要的。
(一)細胞生長與有效成分產量的關係
有效成分的產量往往同細胞的生長階段有密切關係,根據研究有三種類型:
1.平行型有效成分產生曲線同細胞生長曲線呈平行關係。如煙堿、蒽醌、托品堿等。
2.延遲型有效成分產生曲線比細胞生長曲線稍延遲,即有效成分產量高峰比細胞生長高峰來得遲些。如皂甙元。
3.相斥型有效成分量往往要在細胞停止生長或死亡後達到最大值。如多酚和紫草素。
了解各種細胞培養物的生長同其有用物生產的關係,對指導細胞培養工業具有重要作用。
(二)細胞分化與有效成分形成的關係
植物的有效成分形成和積累往往同器官分化有密切關係,並積累在特定的器官中。如罌粟的嗎啡類主要積累在幼果皮中,紫草的紫草素在初生根的皮層細胞中形成。在培養細胞中也發現在多數情況下,有效成分的合成和積累往往伴隨著細胞分化。普遍發現,愈傷組織和懸浮細胞中有效成分含量一般都低於原植物的含量,直至檢測不出,如煙草、黃連、罌粟和黃芩中的生物堿,洋地黃中的強心甙。而當一旦細胞分化,其有效成分開始出現,直至同原植物的含量相當。這一現象說明,細胞脫分化並不是其合成有效成分的遺傳特性喪失,而是一些未知原因使得這種遺傳能力不能表達。這可能是由於:①分化細胞的組織代謝阻斷酶對有用物的降解。②細胞分化形成了積累有用物的組織結構,如同液泡、樹脂導管、膠乳導管一樣,能積累有效成分並解除它對細胞質的毒害作用。
但在細胞培養中,也發現脫分化的愈傷組織和懸浮培養細胞同樣能形成和積累有用物,如紫草的培養細胞能積累紫草素。不少例子表明,可以采用適當措施,使細胞培養物的有效成分含量甚至可高過原植物著中的含量。
盡管如此,有效成分的產生同細胞分化關係,一直受到人們的高度重視。
(三)培養基的成分
培養基的成分對細胞培養的生物量增加和有效成分含量的提高都有密切關係,但二者往往是矛盾的,最主要的是要根據不同種的培養細胞選擇適當的碳源(蔗糖或葡萄糖、果糖、半乳糖),氮源(硝酸態、氨態或有機態)以及其他添加物(如前體、生長激素)。有時前體不足甚至缺乏,可能是影響有效成分形成和得率的關鍵,這時加入必要的前體,有可能使最終產物的產量倍增。如在紫草培養中加入L-苯丙氨酸,使右旋紫草素的產量增加3倍以上。白花曼陀羅培養中加入0.1%酪氨酸,使阿托品的產量增加7倍多。
生長激素是細胞培養中更神奇的物質,通過它可以控製某些細胞培養物的一些有效成分生產,如2,4-D的加入往往阻止多種細胞的有效成分產生,但它可使人參皂甙的產量顯著提高。應當注意,不僅不同生長激素對不同植物的效應不同,而且同一生長激素在不同濃度時,對同一植物的作用也不相同。
(四)培養條件
在植物細胞培養中,光照對細胞的生長和有用物的生產有極大影響。如芸香愈傷組織在光照下培養,其芳香化合物的含量比暗培養下增加1.5~3.6倍。光對歐芹愈傷組織生產黃酮類物質有極其靈敏的作用。但光也能抑製某些化合物的產生,如藍光和白光能使紫草合成受阻,萜烯類合成也能被藍光和強白光所抑製。通氣狀況明顯影響有用物的產生,如豆科植物愈傷組織,在厭氧下大量積累γ-氨基丁酸。
三、藥用植物細胞大規模培養過程中的幾個問題
目前大多數植物細胞大規模培養生產藥物的研究距商業化生產還有一定的差距,主要是培養過程放大中出現的一些問題。
(一)細胞聚集成團
通常植物細胞明顯比微生物個體大,生長慢。植物細胞的長度10~100μm。因細胞分化後不易分離,而且在間歇培養的後期分泌胞外多糖,所以常易聚集成團。聚集體由2~200個細胞組成,直徑能達幾個毫米。不同細胞係、不同細胞年齡、不同培養條件下細胞團的形式也不同。由搖瓶向氣升式反應器放大過程中從懸浮培養液中聚集體顆粒到單個細胞的形態學均發生了改變。另外顆粒的分布也受環境因素的影響。細胞顆粒過大既會影響反應器的混合操作,又會導致大細胞團內部細胞的營養缺乏。但由於一定大小的細胞顆粒對細胞的生長及次生代謝物的形成有利,因而控製細胞顆粒大小是反應器設計與操作應考慮的一個重要因素。
(二)氧氣供應
與微生物相比較,植物細胞代謝緩慢,對氧的需求也相對較少。此氧消耗速率以幹重計為10-6g/g?s數量級,通常認為植物細胞培養物生長需求的臨界溶氧濃度為空氣飽和濃度的15~20%,但在高細胞密度和高流體黏度下會降低氧的傳質效率。因此,實際所需要的溶氧濃度可能顯著高於細胞生長的臨界溶氧濃度。氧氣供應不足,會抑製培養細胞的生長,但是,生物反應器的通氣會產生泡沫,在植物細胞懸浮培養中這個問題尤其嚴重,研究發現泡沫的生成與通氣速率和胞外蛋白含量密切相關。
(三)剪切力