自20世紀60年代,Kaud和Staba對牙簽草(Ammivisnaga)成功地進行了愈傷組織、細胞懸浮和細胞發酵培養之後,藥用植物細胞大量培養的研究取得了飛速發展。目前已對400多種植物進行過研究,從培養細胞中分離到600多種次生代謝產物,其中有60多種在含量上超過或等於其原植物。在植物細胞培養中,選擇高產的外植體,尋找合適的培養條件,是提高植物細胞的生長速度和次生代謝產物的產量,實現工業化的先決條件。藥用植物細胞培養(cellcultureofmedicalplant)是以離體的藥用植物單細胞或細胞團為外植體,在無菌的條件下,通過誘導細胞分裂形成細胞團,進行細胞懸浮培養,或者經再分化生產根、芽等器官,進而形成完整植株的一項技術。藥用植物細胞培養技術不僅為研究細胞的生長和分化、藥用植物抗性細胞突變體篩選、藥用植物轉基因受體係統的建立提供了技術條件,而且通過藥用植物細胞懸浮培養,為次生代謝產物的生產開辟了一條新途徑。
根據植物細胞培養中的培養對象不同,可將藥用植物細胞培養分為細胞懸浮培養和單細胞培養,細胞懸浮培養主要目的是促進細胞生長和生物合成;單細胞培養主要目的是促進細胞生長和形成完整植株藥用植物細胞培養,按培養對象不同,可分為細胞懸浮培養、單細胞培養。
一、懸浮細胞培養
懸浮細胞培養(suspensionculture)是指把離體的單細胞及小細胞團懸浮在液體培養基中進行的無菌培養。它是從愈傷組織的液體培養基礎上發展起來的一種新的培養技術。從50年代起,米爾(Muir)等便對單細胞培養進行了探討和研究,得到了萬壽菊、煙草單細胞和細胞團的懸浮液。1956年Nickell和Routin第一個申請用細胞培養產生化學物質的專利以來,應用細胞培養生產有用次生代謝產物的研究取得了很大進展。許多重要的藥用植物如紫草、人參、黃連、三七、薯蕷、毛地黃、長春花、西洋參、紅豆杉、雷公藤、黃花蒿等細胞培養都較成功,目前有的已發展到全自動控製的大容積發酵罐的大規模工業生產的連續培養。
懸浮培養特點:能夠提供大量較為均勻的細胞,為研究細胞的生長、分化創造方法和條件;細胞可以不斷增殖,形成高密度的細胞群體,適於大規模培養,在藥用植物產品工業化生產上有巨大的應用潛力。
(一)懸浮細胞培養的技術手段
在懸浮培養中,希望建立一種細胞增殖速度快、有用成分含量高、分散程度大的遊離細胞懸浮物。因此在進行大規模生產之前,必須先使愈傷化的細胞能最大程度地分散,再從中篩選出增殖速度快和細胞含有用成分高的細胞株。
1.起始懸浮培養液的製備
懸浮培養是一種把已建立的愈傷組織轉移到液體培養基中起始培養,並需在培養過程中不斷進行較強烈的攪拌或振動,使愈傷組織塊上的細胞被剝落,增加細胞的分散程度。同時在選用起始愈傷組織時,最好選用疏鬆脆弱、生長快的愈傷組織進行起始培養。如果愈傷組織十分緊密,其細胞不易分散,那麼可采用①增加生長激素的濃度,加快細胞分裂和生長速度,②用果膠酶打破細胞間的連接,使成遊離細胞。這兩種方法都是十分有效的。
懸浮培養的另一種材料是取植物的莖尖組織或幼胚在玻璃勻漿器中研磨使軟組織易碎,然後將破碎組織進行液體懸浮振蕩培養。其中既有活細胞也有死細胞及細胞碎片,有遊離細胞也有組織塊,在液體培養下活細胞能分裂繁殖。
實際上,在植物懸浮細胞培養中,即使是由單個細胞的起始懸浮培養所得到的懸浮培養物,也不是完全由單個細胞組成,常常是單細胞和小細胞團的混合體。因為植物細胞具有聚積成塊的固有特性,這種特性給懸浮培養及其應用於研究細胞生長發育帶來不利,這正是細胞懸浮培養物的特征和缺陷。
2.細胞株的篩選
在細胞懸浮培養中,采用生長快、有效成分高、適合懸浮培養的細胞株進行培養,是取得成功的關鍵。因此,在起始培養中首先要選到適於懸浮培養的細胞株。篩選細胞株的方法如下:
(1)用振蕩或酶法遊離出單個細胞和小細胞團經過1~2周的液體懸浮振蕩培養後,得到了第l代懸浮培養物。其中既有遊離的單細胞,又有較易破碎的細胞團,也有大的組織殘塊,應當盡量提高培養物中單細胞所占的比例;所以在繼代培養時,需要用細口的移液管或注射器,隻吸出遊離的單細胞或小的細胞團來接種。必要時可加入少量果膠酶,使組織塊分散成單個細胞。這時培養基中和瓶壁上有大量單個細胞和小細胞團,可把它們收集後,轉移到新鮮培養基中,放在搖床上再次進行繼代培養。也可將第1代細胞懸浮液停止振蕩,讓培養物靜置幾秒鍾,使大的細胞塊和組織塊沉於容器底部,取上部懸浮液進行接種,或在無菌條件下用紗布、不鏽鋼網過濾,用濾液接種。對於分散性不好的材料,往往經多次轉移培養後,分散程度能大大提高。在繼代培養中應通過正交試驗設計多種培養基,著重調整培養基中的植物生長物質的含量,以便確定合適的培養基。
(2)高產細胞株的篩選將懸浮培養物通過約80μm不鏽鋼網過濾,除去細胞團塊。濾液中含有的細胞,經離心或靜止沉澱,濃縮成密度為每毫升2000個的懸浮液。融化含0.5~1.0%(根據瓊脂的質量而定)瓊脂的培養基,待溫度降到約40℃時,將此培養基和細胞濾液以等量混合並迅速倒入直徑為6cm的培養皿中,使其成為一薄層。待瓊脂冷卻凝固後,細胞就會均勻地分布在培養皿中。密封後進行培養。在培養皿中,單個細胞經持續分裂,形成許多細胞株。這時優先選擇生長快、結構疏鬆、分散好的細胞株,再經次生代謝物的定量測定,從中篩選出次生代謝物含量高的細胞株。由於細胞的次生代謝物含量一般都很低,往往要采用十分精密的微量分析方法。常用的有薄層色譜、高效液相色譜、放射免疫等測定方法。
(3)培養基藥用植物細胞懸浮培養常用的基本培養基主要有M5、B5、NT、TR、VR、SS、SCN、SLCC等,這些培養基的配方可參見附錄1。
培養基的組成是藥用植物細胞培養產和積累次生代謝產物的重要因素(Ramachandra,2002年)。對於同一個植物物種而言,用於愈傷組織培養的培養基往往適用於懸浮培養,但在某些情況下,懸浮培養的要求更為嚴格。原種培養時,盡可能用簡單培養基,這樣做雖然可能導致細胞生長緩慢,但有利於其活力的穩定。
①糖水平植物細胞培養通常生長在有碳源非自養的條件下。培養基中的蔗糖濃度影響次生代謝產物的積累量。在鞘蕊花(Coleusblumei)的培養中,蔗糖濃度為2.5%(w/v)和7.5%(w/v)時,可使迷迭香葉寧酸的產量分別為0.8g/L和3.3g/L。在Araliacordate的細胞懸浮培養中,濃度5%(w/v)的蔗糖會降低花色素苷的產量,而在蔗糖濃度為3%(w/v)時則有利於花色素苷的積累。