b.性別、年齡和動物數：一般要求選用兩種性別，每組雌雄各半。特殊情況下如研究某種受試物的性腺毒性或生殖毒性，也可選用單性別的動物。一般選擇離乳不久的動物，大鼠6～8周齡（體重80～100g）。同組動物體重相差不應超過平均體重的10％，組間平均體重不超過5％。大鼠、小鼠每組不少於20隻，犬、猴每組不少於6隻。若試驗要求在試驗中期處死部分動物作中期檢測，則每組動物數量要相應增加。對照組和劑量組動物數應相同，體重、年齡一致。
c.飼養環境：亞慢性毒性試驗周期較長，觀察指標較多，實驗動物的質量、喂飼條件和試驗環境明顯影響受試物的毒性反應。應盡可能使用高等級實驗動物，在符合國家實驗動物標準的試驗環境中進行。亞慢性毒性試驗，應使用清潔級及以上等級大小鼠，並飼養在屏障環境內進行試驗。該環境嚴格控製人員、物品和環境空氣的進出。保持符合規範的溫度、日溫差、濕度、換氣次數、氣流速度、壓強梯度、落下菌數、空氣潔淨度、氨濃度、噪聲和照度。應提供合理營養的飼料、潔淨的飲水、清潔無汙染的墊料和籠具。不同項目的試驗應分室進行。人工控製晝夜交替。
②染毒方式：選擇染毒途徑時要考慮：盡量選擇和人類接觸途徑相似的方式；與預期進行的慢性毒作用研究的接觸途徑相一致。
一般以經口、經呼吸道和經皮染毒為多。經口染毒途徑有三種方式：灌胃法、喂飼法、膠囊法。一般大小鼠建議灌胃法，特別是在要求染毒量準確性較高的情況下。犬采用膠囊法或灌胃法。
染毒頻率通常每日一次，連續給予，如試驗期為3個月或超過3個月時，也可每周6次。經呼吸道染毒的時間通常為每日2～6h，根據設計需要可縮短或延長。工業毒物可以縮短至1h，環境汙染物可延長至8h。每日染毒的時間應保持一致，以保持受試物生物學效應每日相似性。一般在每日上午進行，給藥後喂食。
③劑量選擇和分組：一般至少應設3個劑量組和1個陰性（溶劑）對照組。高劑量組應能引起明顯的毒性或少量動物的死亡（少於10％）。低劑量組應無中毒反應，相當於未觀察到有害作用劑量（NOAEL）。高低劑量組間設置1個中劑量組，比較理想的中劑量組約相當於觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）。通常可根據急性毒性的閾劑量，或1/5～1/20的LD50劑量（同一動物品係和同樣染毒途徑）確定高劑量。高、中、低劑量組距以3～10倍為宜，一般不少於2倍。對於藥物，還常采用人臨床擬用劑量和藥效量作依據，大鼠可用人臨床擬用劑量的10、30和100倍，非齧齒類可用5、15、50倍。
④觀察指標：檢查的項目包括一般性指標、實驗室指標、係統屍解和組織病理學檢查、其他特殊指標檢查。
a.一般性指標：主要指外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量及體重變化等，從中發現一些化學毒物的毒性特征。
外觀體征、行為活動：每日觀察實驗動物出現的外觀體征和行為改變，記錄各體征出現的時間和先後次序，包括食欲、活動、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等，尤其要留意動物被毛的光潔度與色澤、眼分泌物、呼吸、神態、行為等。這些資料有助於分析化學毒物損害機體的部位及程度。
動物體重：動物體重是一個相當重要且比較敏感、客觀的指標，可以用體重直接統計，也可用體重的增長重量，或用體重百分增長率（以染毒開始時體重為100％）進行統計和比較。反映受試物對實驗動物的生長發育及一般狀態的影響。一般每周稱重一次，3個月以後也可每兩周稱重一次。
飼料消耗量：亞慢性試驗期間必須每周觀察並記錄動物的飼料消耗量，並計算食物利用率，即動物每食入100g飼料所增長的體重克數（g體重/100g飼料）。比較各染毒組與對照組動物的食物利用率，有助於了解化學物的毒性效應，尤其要將體重指標和食物利用率結合起來分析。
b.實驗室檢查：通常包括血、尿常規和血液生化指標檢測。由此可發現受試物所致器官損傷和功能紊亂。
血液學檢查：包括紅細胞計數、血紅蛋白含量、白細胞計數及分類、血小板計數、凝血時間等。
血液生化檢查：通常為血清天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、清蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（T-BIL）、肌酐（Crea）、總膽固醇（T-CHO）等。
尿液檢查：包括外觀、pH、蛋白、糖、潛血和沉澱物鏡檢等，可提供與毒物有關的靶器官毒性和中間代謝產物的信息。
c.係統屍解和組織病理學檢查：試驗結束時活殺實驗動物，做係統解剖，進行詳細的肉眼檢查，測定髒器重量並做組織病理學檢查。在試驗中間死亡或處於瀕死狀態的動物，亦應做及時的係統屍解和病理學檢查。
髒器重量和髒器係數：一般稱取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、卵巢或睾丸、腦等髒器濕重，並計算其髒器係數。髒器係數或稱髒體比，指某個髒器的濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某髒器所占的質量，表示為髒器質量（g）/體重（100g）。該指標比較適用於實質性髒器，若某髒器的髒器係數增大或減小，則反映該髒器的腫大或縮小，如增生、充血、水腫、萎縮等變化。
病理學檢查：組織病理學檢查是確定化學毒物對機體毒作用的靶部位、損害的性質和程度，從病理學角度尋找化學毒物與病理改變的劑量效應關係，為了解化學毒物的毒效應及其機製提供依據。
病理學檢查包括：大體檢查、常規組織病理學檢查、酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查、細胞超微結構檢查等，分別從大體、組織、細胞、亞細胞，甚至分子水平等多個方麵發現化學毒物的毒效應。
d.其他指標的檢查：除了上述通常的檢查指標外，常根據受試物毒性資料、試驗中的觀察和受試物的結構等線索增加一些檢查項目。如推測受試物可能對心血管係統有毒性，可進行心電圖、血壓、眼底檢測；對神經係統有影響，可進行神經行為、神經反射等檢查；對電解質、微量元素代謝有毒作用，則檢測血鈣、血磷等含量；還可增加眼科、骨髓項檢查等。病理學方麵除大體解剖和常規病理檢查外，還可根據需要增加酶組織化學檢查、免疫組織化學檢查和細胞超微結構檢查等。總之，為了充分了解受試物的中毒特征，獲得盡可能多的揭示毒性靶器官和中毒機製的線索，亞慢性毒性試驗應認真仔細地選擇觀察指標，如能有特異性指標則更好。所謂特異性指標是指能反映毒物對機體毒作用本質的特征性指標，常與其毒作用機製有關。實際上特異性指標就是生物學標誌。
（三）慢性毒性作用及其試驗方法
（1）慢性毒性（Chronic toxicity）是指實驗動物或人長期（甚至終生）反複接觸外源化學物所產生的毒性效應。所謂“長期”，一般是指2年。對大鼠相當於終生染毒，對兔相當於生命期的36％，對犬為20％，對猴為13％。
（2）慢性毒性試驗的目的
①研究慢性毒性劑量-反應（效應）關係。確定長期接觸造成有害作用的最低劑量（LOAEL）或閾劑量和未造成有害作用的劑量（NOAEL），為製定人類接觸時的安全限量標準，如最高容許濃度（MAC）和每日容許攝入量（ADI）以及危險度評價提供毒理學依據。
②觀察慢性毒性效應譜、毒作用特點和毒作用靶器官。
③觀察慢性毒性作用的可逆性。
④為毒性機製研究和將毒性結果外推到人提供依據。
（3）慢性毒性試驗方法要點
①實驗動物的選擇：慢性毒性試驗選擇實驗動物的原則與亞慢性毒性試驗相同，應使用2種哺乳動物。實際工作中大多用大鼠、犬和猴，經皮染毒也可使用豚鼠和家兔。動物數量要明顯多於亞慢性試驗，每組大鼠40～60隻，犬8～12隻，雌雄各半。如在試驗過程中需要分批處死部分動物時，則應適當增加每組的動物數，以滿足試驗結束時數據統計處理的要求。試驗結束時每個劑量組每性別的齧齒類動物數不少於10隻，非齧齒類不少於4隻。慢性毒性試驗期長，故應選擇年齡較小的動物，一般選初斷奶的動物，即小鼠出生後3周（體重約10～15g）、大鼠出生後3～4周（體重50～70g）、犬一般在4～6月齡時開始試驗。
②染毒途徑和時限：從理論上說染毒途徑應選擇和人類實際接觸相似的途徑，但實際工作中多采用經口染毒，一般每周染毒5～6d。根據需要也可經皮膚染毒和經呼吸道染毒。
慢性毒性試驗動物染毒的期限究竟以多長為宜，應根據試驗具體要求和所選用的動物物種而定。研究工業毒物一般認為染毒6個月或更長時間，環境毒物與食品的慢性毒性試驗染毒期則要求1年以上或2年。也有學者主張動物終生染毒，這樣求得的閾劑量或LOAEL和NOAEL更能準確反映化學物質的慢性毒性作用。如果慢性毒性試驗與致癌試驗結合進行，則實驗動物染毒時間最好接近於動物的預期壽命，甚至動物終生染毒。
③劑量分組：慢性毒性試驗一般設3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設1個溶劑對照組，一般認為以亞慢性毒性試驗的LOAEL等確定。以其1/5～1/2為高劑量組，以1/50～1/10為中劑量組，1/100為低劑量組。
如無亞慢性試驗資料，可以參照LD50值設計劑量，如以1/10 LD50為高劑量組，1/100 LD50為中劑量組，1/1000 LD50，為低劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應當大一些，組間劑量差一般以5～10倍為宜，最低不小於2倍。
合理的劑量設置應能得到如下結果：足夠高的劑量以能觀察到受試物的毒性作用，闡明毒性靶器官，同時試驗能順利進行；有明確的劑量-反應關係，得到理想的LOAEL和NOAEL。
（4）觀察指標與亞慢性毒性試驗相似，亦需進行一般性指標、實驗室檢查、病理學檢查及其他特異性指標的檢查四方麵，每個方麵的觀察指標選擇更多更全麵。以亞慢性毒性試驗所提供的毒效應和靶器官為基礎，重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經顯現的陽性指標。優先采用亞慢性毒性試驗篩選出來的敏感指標或特異性指標。必須指出的是，在慢性毒性試驗和（或）致癌試驗中，組織病理學檢查是非常重要和必不可少的，常常是最客觀和最有說服力的指標。
試驗結束時，部分實驗動物停止染毒，繼續留養1～2個月，進行恢複期觀察，對已顯現變化的指標進行追蹤觀察，有助於了解受試物有無後作用、遲發作用及損害效應的可逆性，為製定衛生標準和確定人類使用的安全限量標準時選擇安全係數提供參考。
五、食品安全性毒理學評價程序
食品安全性毒理學評價程序可參照GB 15193.1—2003。