基因工程原理-第一章

�A+��~圖書在版編目（CIP）數據

基因工程原理　\/　陳豔紅主編.　南京　:　南京大學

出版社,　2020.8

ISBN　9787305231285

Ⅰ.　①基…　Ⅱ.　①陳…　Ⅲ.　①基因工程　Ⅳ.　①Q78

中國版本圖書館CIP數據核字(2020)第137306號

出版發行南京大學出版社

社址南京市漢口路22號郵編210093

出版人金鑫榮

書名基因工程原理

主編陳豔紅

責任編輯劉飛編輯熱線025８３５９２１４６

照排南京南琳圖文製作有限公司

印刷南京鴻圖印務有限公司

開本７８７×１０９２1／16印張18.25字數　435千

版次2020年８月第1版2020年８月第1次印刷

ISBN　9787305２３１２８５

定價49.00元

網址：　http:\/\/www.njupco.com

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微信服務號：　njuyuexue

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基因工程原理

前言

基因工程從1973年誕生至今已有近50年的曆史，發展迅速和應用範圍廣泛是這一學科的兩大特征。擁有良好的基因工程學科基礎有益於學生的專業發展。學生要奠定堅實的專業基礎，大學學習中的教材選擇非常關鍵。我在十多年的《基因工程》課程教學過程中，使用了多種教材，每種教材均有優缺點，所以萌發了親自編寫一本教材的念頭，希望能綜合各家之長並符合當前主流的教學框架設定。希望本教材至少能符合以下三個基本要求：（1）基礎知識要翔實，利於學生打下堅實的學科基礎；（2）章節設置符合邏輯，利於學生形成完整的學科體係；（3）教材內容要新穎，利於學生吸取學科最新的技術和研究進展。

本著這三個目標，我們從2016年秋開始構思教材章節框架，到目前書稿完成第三次校稿已曆時四年半時間。在近幾年時間內，合成生物學及基因治療等基因工程應用領域發展迅猛，我近三年為研究生開授的《生命科學前沿進展》課程，也為教材編寫積累了豐富的最新的研究進展素材。目前書稿完成，本教材除滿足上述三個基本要求外,還有以下幾個鮮明的特點。

（1）詳略得當。對基因工程操作做出重大貢獻，但目前使用較少的技術做了簡明扼要的介紹，對現階段使用比較廣泛的技術原理以及操作過程進行了詳細論述。（2）有益科研。例如在第7章對正向遺傳學和反向遺傳學研究的技術路線以及涉及的基因工程技術，做了比較係統的概括，能起到訓練學生科學思維，引領學生將來從事相關科研和工作的作用。（3）案例具有課程思政元素，展現大國自信與擔當責任。如教材中在多個章節展示了中國科學家近些年在基因工程領域所做的貢獻，具有較高的民族認同感和文化自信，體現了我國高等教育專業課課程思政的宗旨。

教材共八章，主編為南通大學陳豔紅教授，副主編為南通大學餘春梅副教授、煙台大學於天英副教授和天津科技大學王芳副教授。南通大學生命科學學院基因工程教學團隊的趙華老師、林社裕老師和其他老師也對教材編寫提出了有益的意見和建議。

教材編寫得到了生命科學學院領導們,特別是鄧自發教授的支持，得到了南通觀賞植物重點實驗室所有老師的支持。在此對所有編寫人員及支持本書編寫的所有老師和同學表示感謝，對參與教材審定的各位專家表示感謝。

本書的出版得到了江蘇省2019年高等學校重點教材立項支持和南通大學教材出版基金的支持。

限於編寫者的經驗、水平和研究範疇的狹隘，書中定有不少錯漏之處，懇請讀者和同行批評指正！

陳豔紅

2020年8月於南通

第1章緒論1

1.1基因工程概念1

1.2基因工程發展的理論基礎和最初曆程1

1.3基因工程的最新發展3

1.4基因工程研究的意義8

1.5基因工程課程的主要內容11

第2章基因工程基本實驗技術12

2.1生物大分子的提取、分析和檢測12

2.2生物大分子的電泳分析24

2.3基因的序列測定29

2.4全基因組測序的方法策略40

2.5PCR技術47

2.6基因的體外定點突變技術60

2.7分子雜交技術66

2.8核酸和蛋白質的高通量分析73

第3章基因工程常用載體和工具酶80

3.1載體80

3.2工具酶118

第4章目的基因的獲取134

4.1從數據庫中搜尋目的基因序列134

4.2從基因文庫中搜尋目的基因序列134

4.3圖位克隆法獲得目的基因141

4.4插入標簽法獲取目的基因146

第5章基因的克隆和遺傳轉化151

5.1基因克隆151

5.2酵母細胞的轉化和篩選166

5.3植物細胞的遺傳轉化、篩選與鑒定167

5.4動物細胞的轉化和轉基因動物的獲得175

第6章基因工程表達係統182

6.1大腸杆菌細胞中外源蛋白的表達係統182

6.2真核細胞表達係統191

第7章基因組和基因功能的研究方法208

7.1基因組研究208

7.2基因功能研究技術211

第8章基因工程的應用246

8.1基因工程在醫藥和基因治療領域的應用246

8.2基因工程在農業領域的應用258

8.3基因工程技術在法醫學和考古學領域的應用273

參考文獻284

基因工程原理

第1章緒論

1.1基因工程概念

基因工程又稱為基因操作，或DNA重組技術，是指通過某種方法在體外將核酸分子插入到病毒、質粒或其他載體係統，組成一個可遺傳的重組分子，並可導入到其他宿主係統中進行繁殖和擴增的技術。即將一個或多種生物體（供體）基因與載體在體外進行拚接重組，然後轉入到另一種生物體內（受體）進行擴增或表達並使之表現出新的性狀。因此，供體、受體、載體稱為基因工程的三大要素。另外，基因工程還有一廣義定義，即指重組DNA技術的產業化設計與應用，包括上遊技術和下遊技術兩大組成部分。上遊技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即狹義的基因工程定義）；而下遊技術則涉及含有重組外源基因的生物細胞（基因工程菌或細胞）的大規模培養以及外源基因產物的分離純化過程。廣義概念中基因工程的下遊技術又和細胞工程、酶工程和發酵工程等學科有交叉。本教材的重點講述內容集中在狹義的基因工程定義方麵。

1.2基因工程發展的理論基礎和最初曆程

基因工程的誕生得益於基因的分子生物學理論基礎和基因操作的技術基礎兩大方麵的發展。基因的概念最初由丹麥植物學家Wilhelm　Johannsen在1909年提出，但當時基因的概念隻是一個推理的概念，並沒有實驗證據證實。之後的半個多世紀中，科學家們對於基因的化學本質、結構、基因的遺傳和表達調控規律進行了不懈的探索，獲得了一係列重大科學發現。這些發現首先使基因不再是抽象的符號，美國遺傳學家、現代遺傳學之父T.H.　Morgan在果蠅中發現了基因的遺傳連鎖規律，將抽象的基因符號和染色體聯係起來，賦予了基因新的內涵。1927年Frederick　Griffith和1944年Avery的細菌轉化實驗證實了DNA是細菌的轉化因子，細菌轉化後可以使其遺傳特性發生改變，首次證實了DNA是遺傳物質。1953年Waston和Crick在Nature雜誌發表了DNA分子雙螺旋結構模型，從結構上為解釋DNA作為遺傳物質進行遺傳信息傳遞機製奠定了重要基礎。此外，Crick還提出了中心法則的概念，對分子生物學的研究有重大促進作用。1961年，Crick又提出了三聯體遺傳密碼的概念，以Marshall　W.　Nirenberg為首的科學家進行了遺傳密碼的破譯工作，將DNA的分子結構和蛋白質序列有機聯係起來，為闡明基因控製生物學功能的分子基礎奠定了基礎。1961年，Jacob和Monod兩位科學家以大腸杆菌為研究對象，提出了乳糖代謝相關的乳糖操縱子學說，首次闡明了基因結構、功能和基因表達調控間的關係。

在以上對基因的化學本質、結構、表達調控初步了解的基礎上，人們嚐試對基因進行相關操作。對基因進行的操作包括定點切割、兩個不同來源的DNA片段間連接形成重組DNA、在特定位點對DNA進行定點突變和在體外或異源細胞內進行大量擴增等多個方麵。從20世紀70年代開始，各個方麵的技術突破層出不窮。Hamilton　O.Smith、Werner　Arber和Daniel　Nathans等三位科學家在1970年發現了Ⅱ型限製性內切酶，可以在特定位點對雙鏈DNA進行切割，並在同年對猴空泡病毒SV40　DNA進行了酶切。另外一種重要的工具酶是DNA連接酶，大腸杆菌DNA連接酶和T4　DNA連接酶兩種DNA連接酶分別在1967年和1970年被分離。在發現分離兩種工具酶的基礎上，1972年斯坦福大學Paul　Berg小組完成了首次DNA重組試驗。將SV40酶切片段同λ噬菌體DNA酶切片段連接起來，獲得了第一個體外重組DNA分子（圖11）。獲得體外重組DNA分子後，需要將DNA導入到受體細胞中才能使重組DNA擴增。兩個實驗小組分別發現了將DNA導入受體細胞的簡便方法。1970年,夏威夷大學的M.　Mandel和A.　Higa發現經過氯化鈣處理的大腸杆菌細胞容易吸收λ噬菌體DNA；1972年，S.N.　Cohen等人也證明，經氯化鈣處理的大腸杆菌細胞能吸收質粒DNA。接著，DNA複製機理的揭示和第一個重組質粒的產生（1973年，斯坦福大學S.N.　Cohen小組將含有卡那黴素抗性基因的R65質粒與含有四環素抗性基因的質粒pSC101連接，獲得具有雙重抗藥性的質粒）使基因克隆，即重組DNA分子在異源受體細胞的擴增成為可能。同年，非洲爪蟾核糖體RNA基因片段同pSC101質粒重組，轉化大腸杆菌，並在菌體內成功轉錄出RNA分子。這是第一次成功的基因克隆實驗。基因克隆的一般流程如圖12所示。包括載體和目的基因的限製性酶切製備；載體和基因片段的連接；重組載體轉化進宿主細胞；基因在宿主細胞中隨載體擴增而擴增，並且進行基因的轉錄和翻譯（依賴表達載體）。

圖11第一個重組DNA分子的獲得

圖12基因克隆的一般流程

在體外進行DNA片段的高效率擴增得益於Kary　B.　Mullis等人創立起來的PCR技術和熱穩定性的Taq　DNA聚合酶的發現。由加拿大生物化學家Michael　Smith創立的寡聚核苷酸定點誘變技術可以在體外對某個已知基因的特定序列進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。定點誘變技術的潛在應用領域很廣，比如研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的活性或者動力學特性，改造啟動子或者DNA作用元件，引入新的酶切位點，研究蛋白的晶體結構，以及藥物研發和基因治療等方麵。PCR技術、基因克隆技術和定點誘變等DNA操作技術的發展反過來進一步促進了分子生物學理論的發展。基因工程科學的發展也進入了一個新階段。

1.3基因工程的最新發展

在已經建立的分子生物學理論基礎和DNA操作技術基礎上，近三十年中，基因工程技術在生命科學和醫學的基礎和應用研究領域得到了廣泛應用，形成了以基因工程為基礎的大學科。發展到現在，基因工程先後經曆了四個世代的演替。第一代基因工程為經典基因工程，是蛋白多肽基因在體外的高效表達，如胰島素基因在大腸杆菌細胞中的表達，胰島素在原核細胞中合成；第二代基因工程是蛋白質工程。所謂蛋白質工程,就是利用基因工程手段,通過對蛋白編碼基因的定向誘變，對蛋白質進行改造或製造一種新的蛋白質，以期獲得性質和功能更加完善、更符合人類需要的蛋白質分子。如通過對蛋白質編碼基因進行DNA改組和定向進化，對酶進行合理化設計，從而提高酶的活性。第三代基因工程是途徑工程，即利用DNA重組技術嚐試對生物細胞內固有代謝途徑進行改造設計，達到認識生命，改造生命和優化生命的目的。如在現存途徑中提高目標產物的代謝流，增加目標產物的積累。第四代基因工程即基因組工程，分為結構基因組工程和功能基因組工程。測序技術的發展使大量生物的基因組測序成為可能，在NCBI數據庫中可以查閱到5102種真核生物、129963種原核生物和14004種病毒的基因組序列，但對基因組中結構基因的注釋，即功能基因組研究是一個非常大的挑戰。利用各種組學技術，在係統水平上將基因組序列與基因功能（包括基因網絡）以及表型有機聯係起來，最終揭示自然界中生物係統不同水平的功能。麵對這些海量的基因組數據，基因定點編輯技術是高效捕獲目標基因、迅速獲得基因功能和應用信息的重要研究手段。CRISPR\/Cas9是目前最有效的一種基因定點編輯技術。

在基因工程的發展曆程中，值得一提的明星技術有動物克隆技術、RNAi技術、動植物轉基因技術等。動物克隆技術，代表成果為1997年由一頭母羊的乳腺細胞克隆來的克隆綿羊“多莉”的誕生。“多莉”的誕生是真正的無性繁殖。在園藝業和畜牧業中，克隆技術是選育遺傳性狀穩定的品種的理想手段，通過它可以培育出優質的果樹和良種家畜。2005年8月8日，中國第一頭供體細胞克隆豬誕生。RNA幹擾（RNA　interference,　RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（doublestranded　RNA，　dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，被Science雜誌評為2001年的十大科學進展之一。由於使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用於探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。

轉基因技術是指將DNA片段轉入特定生物中，與其本身的基因組進行重組，再從重組體中進行數代的人工選育，從而獲得具有穩定的表現特定遺傳性狀的個體。該技術可以使人們獲得所期望的新性狀，培育出具有抗蟲、抗病、抗除草劑、抗倒伏、品質好、產肉、產蛋量高、生長速度快等優良性狀的新品種。迄今為止，轉基因牛羊、轉基因魚蝦、轉基因糧食作物、轉基因蔬菜和轉基因水果在國內外均已培育成功並已投入消費市場。

最近10多年基因工程的發展，一些新興技術的產生又使基因工程的發展應用進入了一個全新的階段。如各種組學研究、合成生物學研究和RNA介導的基因組DNA編輯技術等。

1.3.1組學研究

組學研究（Omics）包括經典的基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等，還有新近發展的代謝組學、表型組學、表觀基因組學和糖組學等。基因組（genomics）研究應該包括兩方麵的內容：以全基因組測序為目標的結構基因組學（structural　genomics）和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學（functional　genomics)，又被稱為後基因組（postgenome）研究。轉錄組學（transcriptomics），是一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規律的學科。簡而言之，轉錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況。轉錄組即一個活細胞所能轉錄出來的所有RNA的總和，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。蛋白質組學（proteomics，又譯作蛋白質體學），是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物體中蛋白質組成，翻譯後的修飾，蛋白與蛋白相互作用及其變化規律的科學。代謝組是指某一生物或細胞在一特定生理時期內所有的低分子量代謝產物總和，代謝組學（metabolomics）則是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新學科。表型組學（phenomics）是一門在基因組水平上係統研究某一生物或細胞在各種不同環境條件下所有表型的學科。2005年，比利時Crop　Design公司的Christophe等發表具有裏程碑意義的論文，詳細闡述了稱之為“性狀工廠”（Trait　Mill）的可大規模自動化分析全生育期植物表型的技術設施。表觀基因組學（epigenomics）是研究細胞全基因組範圍內表觀修飾變化的學科。基因組的表觀修飾變化是指不改變DNA序列，通過對染色質DNA上的組蛋白修飾和DNA甲基化等來影響基因表達特性。表觀修飾在基因表達和調控中起重要作用，參與到細胞分化、個體發育和癌症發生等多種生命過程。隨著全基因組高通量測序技術的升級優化，使在全基因組水平上研究表觀遺傳修飾現象成為可能。豐富多樣的聚糖不僅是細胞形狀和類型的體現，也參與了細胞發育、分化、腫瘤轉移、微生物感染和免疫反應等細胞生物學行為。糖組學是對糖鏈組成及其功能研究的一門新學科，主要研究對象是聚糖，包括研究糖與糖之間、糖與蛋白質之間、糖和核酸之間的聯係和相互作用關係。

各種組學的發展和交叉為闡明基因調控網絡，解釋生命的自然規律提供了新的平台。2018年開年的一篇有關番茄馴化和育種的研究成果發表在頂級期刊Cell上，深度闡明了多重組學結合的研究在生物學研究中的重要性。

番茄是一種重要的園藝作物。野生番茄是一種果重隻有1～2g，酸澀味濃鬱的野果，經過人類千百年的馴化後，番茄的重量和味道都有了顯著的改良，但是在馴化和育種過程中，果實的營養和風味物質發生了怎樣的變化？2018年1月11日，中國農業科學院深圳農業基因組研究所黃三文研究員實驗室、華中農業大學羅傑教授實驗室及合作者在Cell雜誌發表了題為“Rewiring　of　the　fruit　metabolome　in　tomato　breeding”的研究論文。研究利用多重組學的大數據，通過結合610個番茄及近緣品種的重測序基因組數據、399個品種的轉錄組數據以及442個品種中近980種化合物的代謝組數據，揭示了在馴化和育種過程中番茄果實的營養和風味物質發生的變化，並發現了調控這些物質合成的重要遺傳位點。此研究為植物代謝物的分子調控機理研究提供了源頭大數據和方法創新。同時也為番茄果實風味和營養物質的遺傳調控和全基因組設計育種提供了路線圖。

1.3.2合成生物學研究

合成生物學（Synthetic　Biology）是一個新興的科學技術領域，有人甚至將之稱為“第三次生命科學革命”。現在普遍認為，在現代生命科學中，DNA雙螺旋結構的發現使生命科學研究進入分子遺傳學和分子生物學時代，這是第一次革命；人類基因組測序成功，使我們能夠大規模地“讀取”遺傳信息，並引領生命科學研究進入組學和係統生物學時代，這是第二次革命；而合成生物學是在係統生物學的基礎上，結合工程學理念，采用基因合成、編輯、網絡調控等新技術，來“書寫”新的生命體，或者改變已有的生命體，這將極大提升人們對生命本質的認識水平，其科學意義顯而易見。合成生物學的形成有一係列標誌性事件。在合成基因組方麵，2002年，人類首次合成病毒；2010年，第一個合成基因組的原核生物(支原體)問世；2014年，第一條合成酵母染色體在酵母細胞中呈現正常功能；2017年3月，Science雜誌以封麵故事“逐段重塑酵母基因組”(Remodeling　yeast　genome　piece　by　piece)報道了合成酵母基因組計劃(Sc　2.0)中另外5條染色體的合成。其中4條以中國學者元英進團隊、楊煥明團隊和戴俊彪團隊為主完成。目前，酵母細胞中全部16條染色體的設計與合成大約完成了1\/3。可以期待，首個合成染色體的真核生物不久將問世。

第二個方麵的研究是有關最小細胞或最小基因組研究，研究內容有助於了解基因的功能和理解生命起源。即一個生物體內可能含有必需基因(Essential　genes)和非必需基因，去掉非必需基因以後，該生物體應仍能存活和繁殖。Craig　Venter實驗室從絲狀支原體的901個基因中鑒定出428個非必需基因，然後合成了僅僅含473個基因的簡約版基因組，從而獲得最小合成細胞。合成生物學中最大的突破來自2017年12月美國生物合成領域專家Floyd　Romesberg在Nature雜誌發表了一項新成果。他首次用實驗室合成的XY堿基對和相應的氨基酸，在實驗室內創造出了含ATGCXY六種堿基的全新生命體。DNA由6種堿基組成，理論上可以隨機組合形成216種密碼子，最終編碼172種氨基酸。我們可以想象一下，僅憑64個密碼子，20種氨基酸就能形成地球上那麼多的生命。那麼，216個密碼子，172種氨基酸也就意味著，未來生命的形式更加會有無限可能。在最新發表的《Nature》論文中，他們創造出了能夠使用外來DNA合成蛋白質的健康細胞。為了讓細胞能夠使用這些非天然的堿基，研究人員創建了一種修改版的tRNAs，它的功能是讀取密碼子，並將合適的氨基酸運送到細胞的蛋白質工廠——核糖體中。研究實現了將兩種非天然存在的氨基酸——PrK和pAzF整合到綠色熒光蛋白中。這些新的氨基酸沒有改變綠色熒光蛋白的結構或功能。