第15章 實驗動物的選擇與應用(一)(2 / 3)

(二)作用於心血管係統的藥物研究

抗心肌缺血藥物研究可選用犬、貓、家兔、大鼠和小鼠。抗心律失常藥物研究可用豚鼠,不宜用小鼠,因小鼠不便操作。用犬試驗時,應注意試驗藥物不能用吐溫助溶。

降壓藥物研究一般選用犬、貓或大鼠,腎血管型高血壓大鼠(SHR)是良好的模型動物。降壓藥研究,不宜使用家兔,因家兔外周循環對外界環境刺激極敏感,血壓變化大。治療心功能不全藥物研究常用犬、貓、豚鼠,也可用家兔,一般不宜用大鼠,因為它對強心苷和磷酸二酯酶製劑的強心反應不敏感。

降血脂藥物研究一般選用大鼠、家兔,尤其是遺傳性高脂血症兔是良好的模型動物。抗動脈粥樣硬化藥物研究目前缺乏理想的模型動物,一般可選用家兔和鵪鶉。這2種動物對高脂日糧誘發脂代謝紊亂極為敏感,動脈粥樣硬化極易形成。但是,家兔是草食動物,鵪鶉屬鳥類,其動脈粥樣硬化發病部位及病理改變情況與人類不一致。

抗血小板聚集藥物研究一般選用家兔和大鼠,個別試驗選用小鼠。為避免動物發情周期影響,宜用雄性動物。抗凝血藥物研究常用大鼠和家兔,也可用小鼠、豚鼠或沙鼠等,也以雄性動物為宜。在研究藥物對心髒的作用時,可選擇青蛙和蟾蜍,因為它們的心髒在離體情況下仍有節律地搏動很久。

(三)消化係統藥理實驗中的選擇與應用

1.胃液分泌實驗 胃液收集常選用犬和大鼠。由犬右側嘴角插入胃管收集胃液,大鼠則需剖腹,從幽門端向胃內插入一直徑約3mm的塑料管,在緊靠幽門處結紮固定,以收集胃液,可進行胃酸的測定和胃蛋白酶的測定。

2.胰液和膽汁收集胰液收集可選用犬、兔或大鼠。為了觀察某些藥物對膽汁分泌、膽汁排出以及存在於膽係內結石的影響,需要研究用藥前後膽汁流量及其成分的變化。膽汁可分別給動物做膽囊瘺和總膽管瘺收集。膽囊瘺常選用犬、貓、兔和豚鼠進行,而以犬為佳。在全麻下進行手術,以右肋緣下橫切口的暴露最為滿意。如欲觀察膽汁的分泌情況需要結紮膽囊管或選用大鼠,因後者無膽囊,所以做總膽管造瘺手術常選用大鼠。收集膽汁後可進行各種膽汁的理化指標分析。

(四)作用於呼吸係統的藥物研究

鎮咳藥篩選的首選動物是豚鼠,因為豚鼠對化學刺激或機械刺激都很敏感,刺激後能誘發咳嗽,刺激其喉上神經亦能引起咳嗽。貓在生理條件下很少咳嗽,但受機械刺激或化學刺激後易誘發咳嗽,故可選用貓用於刺激喉上神經誘發咳嗽,在初篩的基礎上進一步肯定藥物的鎮咳作用。犬不論在清醒或麻醉條件下,化學刺激、機械刺激或電刺激其胸膜、氣管黏膜或頸部迷走神經均能誘發咳嗽,犬還對反複應用化學刺激所引起的咳嗽反應較其他動物變異小,故特別適用於觀察藥物的鎮咳作用持續時間。兔對化學刺激或電刺激不敏感,刺激後引發噴嚏的機會較咳嗽為多,故兔很少用於篩選鎮咳藥。小鼠和大鼠給以化學刺激雖能誘發咳嗽,但噴嚏和咳嗽動作很難區別,變異較大,特別是反複刺激時變異更大,實驗可靠性較差。盡管目前也有人以小鼠用氨水或二氧化硫引咳法來初篩鎮咳藥,應盡量少用。

支氣管擴張藥物研究最常用的動物是豚鼠,因其氣道平滑肌對致痙劑和藥物的反應最敏感。利用藥物引喘時,宜選用體重不超過200g幼齡豚鼠效果更佳。大鼠某些免疫學和藥理學特點與人類較接近,如大鼠的過敏反應由IgE介導,大鼠對色甘酸鈉反應較敏感。因此,大鼠氣道平滑肌標本亦常被選用。另外,大鼠氣道平滑肌對氨酰膽堿也較敏感,但對組胺不敏感。

祛痰藥研究一般選用雄性小鼠、兔或貓,用來觀察藥物對呼吸道分泌的影響。觀察對呼吸道黏膜上皮纖毛運動影響的實驗中,可采用冷血動物蛙和溫血動物鴿。家兔因氣管切開時容易出血,會影響實驗結果,不宜采用。

二、免疫學研究中實驗動物的選擇與應用

免疫學的研究,包括從預防感染到區別機體自身或非自身的基本生物現象的研究,一般多選用實驗動物作為對象,而且免疫學上的許多理論知識都是通過動物實驗獲得的,特別是各種近交係和免疫缺陷動物、無菌動物、悉生動物及無特定病原體動物的培育成功,為免疫學研究提供了重要手段,大大促進了免疫學的發展。

(一)影響實驗動物免疫反應的因素

免疫反應是隨著動物種的進化而複雜化、精密化和完善化,不同品種和品係動物的免疫反應有很大差異,因此在免疫學研究中選擇動物時要特別注意動物遺傳因素的影響,還要注意動物的年齡因素、感染因素、營養因素、藥物因素、母源因素、應激因素、免疫抑製劑等因素對動物免疫反應的影響。

1.動物的遺傳因素研究表明小鼠、豚鼠、家兔等動物對特異性抗原的免疫反應受遺傳控製。動物的遺傳背景決定著動物對各種疾病的易感性,決定著自身免疫病和體液免疫反應。這種免疫反應的基因主要存在於動物體內主要組織相容性係統上。

2.動物的年齡因素選擇適宜年齡的實驗動物非常重要,年齡影響著實驗動物的免疫功能,如幼齡動物的免疫係統功能發育不完善或功能很弱。一般來說,動物的免疫功能在青年期達到高峰,以後隨著年齡增大逐漸減弱,主要表現有血清中免疫球蛋白含量低,細胞免疫功能下降,惡性腫瘤和自身免疫性疾病的發病率增高等。根據研究,小鼠、大鼠和豚鼠隨年齡增加免疫反應的活性也減弱,老齡鼠產生IgG和IgM的能力僅為青年、成年鼠的10%左右,細胞免疫同樣也減弱。因此,老齡鼠對誘發腫瘤極為敏感。

3.動物的母源因素各種哺乳類動物的胎仔和初生仔畜免疫的獲得不同,在初乳中主要為IgA,初生動物血清中的母源抗體大部分為IgG,對仔畜預防病毒和細菌感染起著一定的保護性免疫作用。大部分IgA對黏膜表麵起著局部保護作用,而IgG起著總的保護作用。但是母源抗體還有有害作用,它能誘發新生動物溶血病和抑製初生動物的主動免疫。雌性動物將母源抗體轉移給胎仔或仔畜的途徑和特異性不同,這與動物胎盤的結構和類型有關。一般來說,有3種主要的轉移途徑,隨動物種類不同,有的經絨毛膜尿囊胎盤轉移;有的經卵黃囊上皮和卵黃循環轉移;還有是初乳經腸道吸收。前兩者被認為是胎仔期獲得抗體的途徑,後者為出生後轉移抗體的途徑。免疫球蛋白的轉送是有選擇性的,有些種類的抗體易轉移,同種(係)抗體轉移比異種抗體快。胎盤對各種母源抗體也有選擇性,如靈長目中IgG 易通過胎盤屏障,IgM、IgA和IgE則不能;家兔的IgG和IgM易通過胎盤到達胎仔。關於母源抗體選擇性的轉移機製還不清楚。

4.動物的感染因素病毒、細菌、真菌或寄生蟲的感染都能多方麵地改變動物機體的生理功能,這種改變無疑將影響到動物的免疫係統。動物感染可引起繼發性營養不良,從而影響到免疫反應。一般實驗動物常發生病毒的隱性感染,在以下幾方麵影響免疫功能:①抗體產生的方式;②免疫球蛋白的數量;③免疫耐受性的產生,植皮排斥,植皮對宿主的反應;④遲發型變態反應;⑤淋巴細胞轉化和吞噬作用等。

動物病毒感染引起的免疫抑製表現:①幹擾正常免疫係統的功能;②改變抗原的吸收和處理;③破壞抗體形成細胞和漿細胞(如白血病病毒);④病毒感染後也可引起免疫增強的表現。

(二)實驗動物免疫反應的特點

1.靈長類(除人外)靈長類動物主要有4種免疫球蛋白,即IgG、IgM、IgA和IgE。新界猴(除一種卷尾猴外)沒有發現IgA。已證明在獼猴、狒狒和黑猩猩中有抗寄生蟲性抗原的IgE抗體,但在新界猴中仍無此種抗體。高等靈長類與人的免疫球蛋白有較強的交叉反應,但長臂猴例外。靈長類動物具有血性絨毛膜胎盤,隻允許IgG通過,IgM、IgA和IgE是不能通過的。新生的猴不能從初乳中吸收抗體。

2.犬犬的免疫球蛋白有IgG、IgM、IgA、IgG1和IgG2.在犬花粉病和各種蠕蟲感染中發現有IgE。Patterson等指出成年犬對各種蛋白抗原隻產生少量的循環抗體。胎仔和新生犬也有類似情況。犬除用做一般移植研究外,也越來越多地作為免疫病研究的動物模型。除人之外,對氣溶膠出現變態反應的動物,犬大概是僅有的一種。因此,人的變態反應和氣喘的研究,犬是適宜的動物模型。人花粉病的臨床表現為結膜炎、鼻炎和皮炎,犬季節性花粉病多數隻有皮炎,無眼和呼吸道症狀。人的這種變態反應是由IgE引起的,犬由豚草花粉致敏後,血液和皮膚中也有IgE抗體。

3.兔兔常被用於實驗室製備抗體。由於所用兔的品種、品係和個體的不同,對某種抗原產生抗體的能力也不同。有些品係的兔,至少有20%產生的抗體效價低或無效價,為了得到高效價的血清,一般多采用10隻兔作為一組進行免疫。兔被用來做過敏反應的研究,IgG和IgE引起的過敏反應,臨床症狀相似,機製都是抗原-抗體結合和血小板-白細胞凝集形成沉澱物,釋放藥理活性物質(組胺和5-羥色胺)進入肺循環,在右心的流出道中產生一種機械和藥理的聯合作用,導致循環性虛脫。IgG誘發血小板或嗜堿性的細胞釋放影響血管的胺要依賴補體的作用,而IgE誘發釋放的胺不依賴補體。

4.豚鼠豚鼠中已確定的免疫球蛋白有:IgG(IgG1、IgG2)、IgA和IgE。IgG1是變態反應的媒介,IgG2與小鼠的IgG1和IgG2相似,在抗原——抗體作用中起結合補體的作用。豚鼠除作為補體的來源外,已廣泛用於免疫的發生和遲發型變態反應的研究。豚鼠的皮膚已被用於結核菌素的皮內試驗和接觸過敏物質的遲發型變態反應的研究。豚鼠和人的結核菌素反應差別是有無細胞浸潤。另外,豚鼠的遲發型變態反應在24~48h達到高峰,人在48~96h達到高峰;人和豚鼠接觸敏感的化學物質引起的變態反應,細胞反應非常相似,而對皮內接種抗原的反應卻有明顯的不同,豚鼠比人有更多的白細胞和巨噬細胞對抗原起反應。當進行免疫學研究選擇豚鼠時,應特別注意機體本身的因素,如年齡、體重、飲食和遺傳因素。

5.小鼠小鼠的免疫球蛋白有IgM、IgA、IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b。近交係小鼠對不同抗原的免疫反應是在常染色體的遺傳控製之下,這種常染色體上有支配免疫反應的基因(Ir),基因連接在主要組織相容位點(H-2)上。基因Ir好像同T細胞的功能有關係,與B細胞的關係不大。小鼠雖然能產生遲發型變態反應,但很少見到典型的表皮反應,也不像其他動物那樣有規律。小鼠能被誘發產生速發型變態反應,它的全身性過敏反應的特點是循環不暢,循環性虛脫,常在幾小時甚至10~20min死亡。

6.大鼠在大鼠中,連接在主要組織相容複合體(H)上的免疫反應基因(Ir)控製著對GT(L-穀氨酸和L-酪氨酸)和GA(L-穀氨酰胺和L-氨基丙酸)的免疫反應,豚鼠與其相似。大鼠和豚鼠的免疫反應基因控製著體液抗體反應和細胞免疫。已經證明,大鼠對綿羊細胞(SRBC)和牛γ球蛋白(BGG)的免疫反應有品係的差異。大鼠有反應素抗體IgE,蠕蟲感染常能誘發大量的IgE抗體,它們存在於血液循環之中。常規的免疫法隻能使大鼠產生少量反應素,在體內存在的時間較短。

7.豬已經知道豬有3種免疫球蛋白,即IgG(IgG1和IgG2)、IgM和IgA。豬初乳中的免疫球蛋白主要是IgG(其中IgG1為主),其次是IgA。泌乳2~3天後,乳中IgG和IgM迅速下降,但IgA的量仍保持相對穩定。豬的IgA同人的IgA有交叉反應。IgA有單體和存在於分泌中的雙體2種,它們分別為7S和10S。腸道固有層中包含著多量分泌IgA的漿細胞。

三、單克隆抗體研究中實驗動物的選擇與應用

雜交瘤合成單克隆抗體(monoclonal antibodies,McAb)是近年來生物醫學研究中的一項重大突破。從根本上解決了免疫學中長期存在的“特異性”和“重複性”問題,在生物醫學領域內發揮了巨大作用。目前,雜交瘤單克隆抗體的應用範圍愈來愈廣泛,已經深入到整個生物醫學的各個領域,幾乎所有抗原物質都可以應用這項技術獲得針對單一抗原決定簇的單克隆抗體。所以,可以說它是一把分子刀,用它可以剖析任何一種抗原物質的細微結構;它又是一種均質的、高特異性的抗體,可用它研究免疫學、遺傳學、腫瘤學和其他學科中各種複雜的現象,同時還可用於診斷各種疾病,包括惡性腫瘤;它又可當做一種藥劑治療某些疾病,甚至腫瘤;還可以用於提純各種蛋白質。實驗動物在雜交瘤單克隆抗體技術中占有極為重要的作用,它是形成單克隆抗體的必須條件。

(一)常用於淋巴細胞雜交瘤技術的實驗動物

1.近交係BALB/c小鼠它是此技術中最常用的動物。目前用於細胞融合的小鼠骨髓瘤細胞幾乎都來源於BALB/c係小鼠。其雜交瘤可接種於BALB/c或它的雜交F1代小鼠,從帶瘤動物取血清或腹水製備單克隆抗體。

2.大鼠LOU(又稱LOU/Wsl)係LOU/C大鼠8個月齡以上的雄鼠自發性漿細胞瘤發生率為30%,而雌鼠為16%,常發生在回腸淋巴結,其中60%的這種漿細胞瘤合成單克隆免疫球蛋白IgG1(35%)、IgE(36%)或IgA。LOU/C與LOU/M的組織相溶性相同,可以互相接種進行皮膚移植。

在雙特異性單克隆抗體(BSMCA)的研究中,就必須要使用LOU大鼠。同時,用LOU大鼠製備單克隆抗體其腹水產量比用BALB/c小鼠大幾十倍,能較好地解決單克隆抗體的大量製備問題。雙特異性單克隆抗體技術和雜交-雜瘤技術是單克隆抗體技術的新進展,BSMCA可代替交聯劑,代替酶標技術,在免疫組織化學和免疫測定技術中有廣泛的應用價值,在癌症的導向治療和體外免疫掃描診斷上有廣闊的應用前景。

(二)實驗動物的自發性和誘發性骨髓瘤

1.自發性骨髓瘤根據報道能合成免疫球蛋白的腫瘤存在於犬、馬、地鼠、大鼠和小鼠。除大鼠、小鼠外,這類腫瘤在其他動物僅偶然發現,故未能廣泛用於研究。在小鼠中,與Ig產生相關聯的腫瘤包括漿細胞瘤(骨髓瘤)和淋巴瘤。這些腫瘤能分泌Ig或有Ig結合在細胞表麵,或分泌與表麵結合同時存在。至今研究最廣泛的、能產生Ig的小鼠腫瘤為漿細胞瘤。其來源為單克隆性,幾乎每一種漿細胞瘤細胞都隻產生一種Ig分子,含有相同的輕鏈和重鏈。小鼠自發性漿細胞瘤最常發生於回盲部黏膜固有層,伴有黏膜潰瘍和黏膜下炎症,晚期腫瘤轉移至腸係膜淋巴結。

2.誘發性骨髓瘤1959年Mervin首先報道BALB/c小鼠誘發性漿細胞瘤是將裝有C3H小鼠乳腺癌組織的微孔擴散盒植入小鼠腹腔,6個月後在腹膜下結締組織發生漿細胞瘤或纖維肉瘤並有出血性腹水。後來發現,BALB/c小鼠腹腔注入Freund 佐劑可誘發漿細胞瘤,隻注射礦物油也可誘發漿細胞瘤。其誘發可能與多種因素有關,最重要的是遺傳因素。BALB/c小鼠有獨特的敏感性,漿細胞瘤誘發率很高,其他純係小鼠如DBA/2、A/He、C57BL/He、C57BL/Ka、C3H/He等,注射礦物油或植入擴散盒僅偶見誘發漿細胞瘤,BALB/c與其他品係小鼠雜交的第1代,注射礦物油的誘發率一般很低。另一有關因素是激素,BALB/c小鼠注射礦物油時,雄性鼠誘發率比雌鼠高,雌鼠注射睾丸酮可提高誘發率,注射孕酮、雌二醇、皮質醇則可抑製漿細胞瘤發生。

(三)用於融合的動物骨髓細胞係

淋巴細胞雜交瘤(lymphocytic hybridoma)技術需要骨髓細胞係(myeloma cell line)。在淋巴細胞融合技術中,理想的骨髓瘤細胞係應能獲得高融合率,並得到產生特異性抗體的雜交瘤。有些骨髓瘤細胞係不僅融合率不高,而且本身分泌免疫球蛋白(Ig),致使雜交瘤細胞仍分泌親係骨髓瘤的Ig鏈。

現已建立的用於B細胞雜交瘤技術的小鼠和大鼠的骨髓細胞係有下列幾種。

1.小鼠骨髓瘤細胞係小鼠P3-NS1/1-Ag4-1、小鼠P3-X63-Ag8、小鼠P3-X63-Ag8.653、小鼠P3-X63-Ag8-U1、小鼠SP2/O-Ag14、小鼠45.6TG1.7、小鼠45.6TG1.7.5、小鼠PuBul-Ou。

2.大鼠骨髓瘤細胞係在細胞融合技術中,使用大鼠骨髓瘤細胞係的優點是,從帶瘤大鼠得到的血清和腹水量約比小鼠高10倍,適於大量生產McAb或同種異型的抗大鼠抗體。主要有大鼠Y3-Ag1.2.3、大鼠YB2/O。

四、腫瘤學研究中實驗動物的選擇與應用

研究腫瘤的病因學、發病學、腫瘤細胞的生物學特性、腫瘤和宿主的相互關係、腫瘤的診斷預防和治療等有關腫瘤的一切知識的總體稱為腫瘤學(cancerology)。它分為兩大領域:臨床腫瘤學和實驗腫瘤學。前者以人為主要對象,主要目的是預防和診治這一疾病;後者的對象較為廣泛,主要以實驗室手段探索與腫瘤有關的各方麵課題,以其各項成果為前者服務。在實驗腫瘤學研究中,實驗動物是其主要研究對象和材料,通過動物實驗,創立了實驗腫瘤學,發現了化學致癌物質和致癌病毒,推動了腫瘤學的研究,為腫瘤的防治開辟了廣闊的前景。特別是各種高癌近交係動物的培育成功,對腫瘤的病因學、發病學、實驗治療和新抗癌藥物的研究等都發揮了重要作用。

(一)實驗動物的腫瘤學特點

1.不同種屬動物

(1)靈長類動物從種係發生上看,非人靈長類實驗動物與人類的親緣關係最近,它們也會發生各種形態上和生物學性質上與人的腫瘤相似的病變。已知它們的腫瘤發病率與動物的種屬、性別、年齡及捕養的時間有關。在實驗室條件下,獼猴的自發性腫瘤發病率較高。

(2)大型實驗動物這裏包括家畜。這些動物腫瘤發病率隨種屬而異,例如,雌犬常發生乳腺腫瘤,母牛則否。但雌犬所發生的乳腺腫瘤與人乳腺癌的表現不同。前者是混合型的,不僅包括上皮性成分,還包含有骨和軟骨等組織。豬常發生腎母細胞瘤,家犬、家貓、馬、羊、牛等則否。馬傾向於發生陰莖癌,羊和牛則會發生肝癌。家犬、馬和牛的黑色素瘤較之家貓、羊和豬為多見。

(3)小型實驗用哺乳動物這裏主要指齧齒類實驗動物。小鼠的腫瘤,無論在組織發生、臨床過程以及組織形態學都與人類腫瘤有相似之處。大鼠也廣泛地應用於腫瘤研究的許多領域之中,它的體形較大,供給的組織較多,便於進行手術、注射等實驗操作。但大鼠的自發性腫瘤的總的發病率遠較小鼠為低。豚鼠曾被認為是很少發生腫瘤的實驗動物,但是,近年來的研究發現,它們也會自發多種腫瘤。

2.不同類型的實驗動物

(1)近交係實驗動物應用這一類型實驗動物的腫瘤研究者,主要著眼於實驗動物腫瘤方麵的遺傳性狀。不同近交品係動物有著不同的遺傳性狀,其自發瘤發生率有明顯的不同,對同一致癌物質的敏感性也往往不同。因此,為了不同的腫瘤研究需要,可以選用在腫瘤學上具有不同的遺傳性狀特點的近交係動物進行研究。

近交係動物自發瘤的發生率高低不等,有一些高癌係小鼠,隻要到一定的年齡,無需任何外加的處理,幾乎可以100%地自然發生,如白血病、肺癌或乳腺癌等惡性腫瘤,從而證明了癌症是可以遺傳的。同樣,也可以通過遺傳學的方法培育出對致癌因子敏感性高或低的動物品係來,說明誘發腫瘤的發生相當程度上也取決於動物的遺傳組成。這些高癌品係的動物是腫瘤學研究的重要工具。例如,C3H近交係小鼠是一種乳腺癌高發的品係,其體內有一種乳腺癌病毒即乳汁因子,可以通過授乳而傳給子代,C3H雌鼠在乳汁因子和激素(多次妊娠)的作用下極易發生乳腺腫瘤。在實驗腫瘤學研究中,要以實驗動物為對象,絕大多數以使用近交係小鼠和大鼠動物為宜。這樣做,便於實驗設計,使動物實驗結果準確、均一、經濟及有可能重複再現等。選用任何一個品係動物時,應先熟悉該品係動物在腫瘤以及其他方麵的性狀特征,以利於實驗設計、結果分析和總結。