不久，他在物理學上又有了新的重大突破。他在1925年引入了一種最為巧妙的形式體係：將力學量表示成厄密矩陣，各矩陣元對應著定態間一切可能的躍遷過程，他發現了可以導出這些定態的能量和相應的躍遷過程的幾率。這就是海森伯格創立的矩陣量子力學，它同施羅丁格於次年創立的波動力學都是人們研究微觀世界必不可少的強大工具。
1926年，海森伯格關於氦光譜的奇特雙線的解釋對處理電子原子作出了具有決定意義的貢獻。多年來，這種雙線性一直是原子構造量子論的主要障礙之一，海森伯格探索了波函數在位形空間中的對稱性質，成功地證實了這樣一個事實：氦原子的定態分為兩類，分別與兩組不相並合的譜項相對應，並且分別以和反向電子自旋、平行電子自旋相關聯的對稱的與反對稱的空間波函數來表示。
當時，正是原子物理學迅速發展的時期，人們的興趣越來越集中在整理豐富的實驗數據上。海森伯格在哥本哈根的最後一年中，在長期考察和反複論證的基礎上，發表了著名論文《量子論中運動學和力學的形象化內容》，第一次提出了測不準關係，這對闡明量子力學的物理內容作出了重要貢獻。測不準關係指出：如果同時測量兩個正則共軛變量，例如位置和動量，則其測量值的不準確度之乘積不能小於大致為普朗克恒量除以2π的數。測不準關係也反映了被觀察體係和測量工具之間的相互作用。海森伯格的測不準原理成為量子力學的重要原理，他因此於1932年榮獲諾貝爾物理學獎金。後來，在這一原理的基礎上，尼爾斯·波爾又提出了波粒兩種觀點之間互相補充的“並協原理”，這種原理後來成為哥本哈根學派的基本觀點。
1927年到1941年，海森伯格擔任了萊比錫大學的教授，並且開辦理論講座。這個講座對於推動德國物理學的研究起了重要作用。當時，德國研究理論物理學中心在普朗克研究院，這個研究院的兩個重要研究所分別設在柏林和哥本哈根。他曾先後擔任過這兩個研究所的所長。在這期間，他又提出了關於韋斯鐵磁性理論的量子力學解釋，並且把電磁場看作動力學體係，與奧地利物理學家泡利共同提出了電子和電磁場相互作用的相對論量子力學，這成為後來發展起來的量子場論的先驅。1932年，海森伯格又提出了兩核子間的吸力是“交換力”，並引入同位旋概念，用以強調這種交換力和電荷無關。
1941年到1945年，海森伯格在柏林大學任教授，並兼任馬克斯·普朗克物理研究所所長。在這期間，他的理論又有了新的發展，1943年時，提出了粒子相互作用的散射矩陣理論。
從1946年到1958年，海森伯格又受聘於哥丁根大學，擔任教授，同時兼任哥丁根的馬克斯·普朗克物理學和天體物理學研究所所長。在這期間，他提出了大雷諾數湍流的統計理論，並且對在1951年到1953年期間反對哥本哈根學派量子論解釋的各種意見進行了反駁。
1976年2月1日，著名的理論物理學家維爾納·海森伯格在慕尼黑逝世，終年75歲。
為了探索物質結構的秘密，成千上萬名物理學家、化學家進行了精確而有說服力的實驗。如果說過去這些實驗是在黑暗中進行的話，那麼自從有了相對論和量子力學以後，現代物理學就有了強大的探照燈，這強大的物理學理論的燈光照亮了科學向前發展的道路。之所以有如此的成就，就是因為海森伯格一生本著這樣的原則：對自己所從事的學術，一定要酷愛，要有興趣，這樣，才能產生研究的動力，才不會感到是被迫的，甚至是勉強的。
高爾基言道：“天才是由於對事業的熱愛而發展起來的，簡直可以說天才，就其本質論——隻不過是對事業、對工作過程的熱愛而已。”隻要飽含有熱情，隻要附注於熱衷，即使再有困難，那也隻是暫時的，短暫的，而最終你會取得成功。