這時，波斯軍獲悉了亞曆山大患病的消息，他們非常高興，對這次的戰爭躍躍欲試。即將到來的顯然是非常重要的一場戰役，兩軍都摩拳擦掌，耀武揚威，急於要將對手打敗。這時亞曆山大把傷殘的士兵留在伊蘇斯，然後以最快的速度沿著敘利亞南下，朝波斯軍隊所在的敘利亞關口趕去。可是亞曆山大卻對留守的營地忽略了警戒，波斯人偏偏鑽了這個空子，從後方占領了亞曆山大在伊蘇斯的營地，俘虜了所有的傷員和物資，截斷了亞力山大的後路，然後在伊蘇斯南20公裏處安營紮寨，嚴陣以待，從而斷絕了亞曆山大的交通線。此舉出乎亞曆山大意料，他感到非常震驚。但他沒有驚慌，在探明消息後，亞曆山大決定擊潰大流士的軍隊，為此將自己的軍隊折回伊蘇斯。兩軍在河邊相遇，亞曆山大下定決心要迎戰波斯軍。
伊蘇斯古戰場位於敘利亞北部的河畔平原。河水的洶湧和河岸的險峻對波斯軍的防禦十分有利。可是也因為麵臨大河，陣容強大的波斯軍很難在這狹小的平原上展開，隻得化整為零。這一點對亞曆山大來說倒是非常幸運的。可是身經百戰的亞曆山大在這個時候也很難隱藏內心的不安。根據史書的記載，在戰爭開始之前，亞曆山大深感不安，不停地向海神祈禱。這位海神傳說是奧德修斯的母親，奧德修斯在最困難的時候曾經對著大海痛哭，如今亞曆山大又一次自比為奧德修斯，向海神母親求得安慰。
亞力山大率領馬其頓大軍穩步前進，不時停頓以保持陣型的完整緊湊。馬其頓右翼的近衛騎兵率先進入波斯人的弓箭射程，正停下來等待左側的近衛步兵方陣跟上來，河對岸的波斯弓箭手立刻萬箭齊發，羽箭密集如雨。雖然波斯箭雨未能對亞曆山大的騎兵造成多大的威脅，但有數十匹戰馬受驚狂跳。亞力山大見此情形，不等步兵跟上來，率先衝向敵陣，他的騎兵連隊以楔形隊形緊隨其後。馬其頓騎兵衝進河中時又遭遇波斯部隊迎麵而來的弓箭直射，但這仍沒有擋住亞曆山大，反而在大概三次齊射的時間裏，亞力山大已經率領近衛騎兵衝到近前。對麵的弓箭手嚇得魂飛魄散，轉身便逃。慌不擇路的波斯逃兵衝亂了後麵的陣型，接踵而至的馬其頓重騎兵如摧枯拉朽一般突入波斯步兵陣營，而馬其頓步兵各個方陣也陸續過河迎敵，將波斯防線的缺口越撕越大。由於波斯步兵方陣異常密集，馬其頓重騎兵突進敵陣以後很快就被人海堵塞得寸步難行。騎兵習慣於高速衝擊，並不擅長在狹小空間裏同步兵肉搏，這時馬其頓跟進的步兵投出手中的長矛以後，紛紛拔出短劍衝入敵陣與敵人近身廝殺。在馬其頓軍隊各部隊協同作戰的淩厲攻勢之下，波斯左翼陣線不久便土崩瓦解。幾乎在亞力山大率領騎兵發動進攻的同時，波斯右翼的鐵甲騎兵也向馬其頓左翼遠端發起衝鋒。由於這裏的戰場寬度不足500米，波斯騎兵不得不逐次投入兵力。第一波的數千鐵甲騎兵組成密集隊形衝到河對岸，朝600希臘騎兵猛撲過來，很快將他們擊潰，然後左轉向馬其頓左翼陣線的側後迂回包抄，從兩麵攻擊2000弓箭手和標槍手。馬其頓左翼陣線岌岌可危。在這關鍵時刻，亞力山大部署陣後方的重騎兵發動反擊，猛攻波斯騎兵的右側，一舉衝散了敵軍的隊形，逼迫波斯騎兵後退重新集結，並不斷向忙於集結的波斯騎兵發動連續短促的突擊，最後將波斯人驅逐到河對岸。
而另一隊馬其頓方陣冒著箭雨艱難地爬上陡峭的河岸，越過波斯人設置的障礙，向波斯陣線的希臘雇傭軍發起進攻。過河以後，許多馬其頓士兵受地形阻礙沒能跟上，這樣密集陣前沿就出現了許多缺口，而右側同亞力山大的近衛步騎兵已經脫節，希臘雇傭軍所期待的戰機終於出現。大批手持圓盾和短劍的希臘雇傭軍士兵立刻衝進馬其頓陣線的缺口，猛攻密集陣暴露的部位，馬其頓步兵不得不扔掉長矛，拔出短劍格鬥。伊蘇斯這場戰役中最血腥殘酷的一幕發生了。雙方士兵風格相似，實力相當，彼此以死相拚，殺紅了眼，仿佛希臘和馬其頓兩個民族之間的新仇舊恨要在此一並清算。馬其頓陣營傷亡慘重。希臘雇傭軍逐漸將馬其頓軍隊逼退。而在波斯左翼潰散以後，馬其頓的右翼在亞力山大的指揮下向左旋轉，開始攻擊希臘雇傭軍的左翼，而亞力山大率領近衛騎兵從側後方直撲大流士。波斯的希臘雇傭軍抵擋不住來自兩麵的攻擊，不久陣型就瓦解了，但是頑強的雇傭軍士兵們依然三五成群和步步逼近的馬其頓密集陣殊死搏鬥，想起格拉尼庫斯戰役中那些希臘雇傭軍的下場，他們個個抱定了必死的決心。亞力山大手持長矛衝在隊伍的最前麵，完全不顧自己的安危，近衛騎兵在主帥身先士卒的感召之下奮勇向前，很快馬其頓騎兵就衝到了大流士的2000禁衛騎兵陣前。以大流士的兄弟為首的一批波斯貴族和他們的衛隊全力護在大流士的周圍。但在這場混戰中，波斯人幾乎無組織地單打獨鬥和馬其頓人的組織紀律性形成鮮明對比，大流士的戰車周圍，陣亡將士的屍體堆積如山。廝殺中大勢已去的波斯王充滿恐慌的眼睛正好與亞曆山大炯炯的目光不期而遇，慌亂中波斯王在馬車上猛力揮鞭，絕塵而逃。喪失了總指揮的波斯軍隊瞬間土崩瓦解，亞曆山大緊追不舍，直到波斯王逃進了山中，亞曆山大才勒住了馬韁停止追擊。