中醫方證代謝組學
綜述
作者：張愛華 孫暉 閆廣利 王萍 韓瑩 王喜軍
[摘要]證候和方劑是中醫學的2個關鍵科學問題，直接關係到中醫疾病的診斷和臨床治療的有效性。方劑是中醫臨床用藥的主要形式和手段，其配伍的科學性和臨床的有效性是中醫藥科學價值的具體體現。然而，中醫證候的模糊性及方劑的複雜性極大地限製了方劑的效應評價及中藥藥效物質基礎的確認。如何解決證候的診斷標準，以及相關的方劑藥效物質基礎的確認是國際關注的熱點問題，迫切需要建立符合其自身特點的研究方法和技術體係。中醫方證代謝組學（chinmedomics）是將中藥血清藥物化學和代謝組學有機結合，在解決證候生物標記物的基礎上，建立方劑藥效生物評價體係，進而發現與臨床療效直接相關的藥效物質基礎，闡明作用機製的方法學體係。中醫方證代謝組學將“中醫證候生物標記物-方劑體內直接作用物質-藥效生物標記物”研究有機結合，建立血清中外源性中藥成分與內源性標記物群2組變量相關（plotting of correlation between marker metabolites and serum constituents，PCMS）分析方法，評價方劑整體效應及方證相應關係，揭示方劑的藥效物質基礎及其配伍規律的應用研究策略；該策略的實施將促進方劑向化學成分明確化、作用機製清晰化的方向發展，為方劑關鍵科學問題研究帶來方法學創新，有助推動中醫方-證相關研究，揭示生命本質並為人類健康做出有益貢獻。
[關鍵詞]中醫方證代謝組學；中藥血清藥物化學；代謝組學；方劑；藥效物質基礎；證候；生物標記物
Chinmedomics： a new strategy for research of traditional Chinese medicine
ZHANG Ai-hua， SUN Hui， YAN Guang-li， WANG Ping， HAN Ying， WANG Xi-jun*
（National Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry， Laboratory of Metabolomics and Chinmedomics， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）
[Abstract]Syndrome and formulae （or prescription） are two key issues in traditional Chinese medicine （TCM） and the premise research for material basis of TCM. However， vagueness of syndromes and complexity of formulae greatly limited the evaluation to syndromes and effective substance basis of prescription. Therefore， how to solve the evaluation of syndromes， confirming the efficacy material basis in prescription are the current hot issues of international concern. To solve these problems， establishing chinmedomics by integrated serum pharmacochemistry of TCM with metabolomics technology， that is a unique method of TCM research， made outstanding contributions in solving international concerns such as the effectiveness and security aspects of TCM. On the basis of the biological characterization of syndrome， the metabolic profiling of animal models of TCM syndrome， and related metabolic fingerprints as well as metabolic biomarkers were established to evaluate the overall effects of TCM formulae and corresponding relationship of syndrome-formulae. The active constituents were screened using the plotting of correlation between （endogenous） marker metabolites and （exogenous） serum constituents （PCMS）， and is ongoing verification by further biological experiments. Correlation analysis between the ingredients in the body after oral formulae and endogenous markers in vivo can be used to clarify the active ingredients and synergistic properties. This method was successfully applied for rapid discovery of potentially bioactive components and metabolites from TCM， and through a series of studies on the chinmedomics， it proved that the established method could help to explore the effective substance for further research of TCM. As a new research approach， Chinmedomics is the best method to fit the holistic concept of TCM， and it can _disibledevent=[（AUCn，k/w-AUCm，k/d）-]/Sk|（3）
3.4生物學驗證針對現有篩選中藥有效成分時間周期長、耗費大、成本高等問題，本實驗室以茵陳蒿湯為例，利用UPLC-MS建立體內分析指紋圖譜，在大鼠肝損傷模型基礎上，采用代謝組學手段研究茵陳蒿湯治療作用，通過PCMS分析方法研究茵陳蒿湯抗肝損傷的潛在藥效物質基礎，並進一步通過整體及細胞水平進行生物學驗證。茵陳蒿湯體內入血21個化學成分中18個是藥效相關峰。其中6個化學成分（geniposide，6，7-dimethylesculetin，rhein，6，8-dimethoxy-7-hydroxycoumarin，5，6-dimethoxy-7-hydroxycoumarin，quercetin-3-O-glycoside）與代謝生物標記物顯著相關，是茵陳蒿湯抗肝損傷的潛在藥效物質基礎。geniposide，6，7-dimethylesculetin，rhein與代謝效應呈極顯著相關，基於乙醇誘導原代小鼠肝細胞損傷模型，進一步藥效驗證這3個化合物是茵陳蒿湯治療肝損傷的藥效物質。采用PCMS分析方法將中藥入血成分量的變化與藥效結果聯係起來，確定與藥效相關的化學成分群，突破了傳統藥物研究模式，具有提高有效組分篩選效率，縮短篩選周期的優勢。本方法已開發出相應PCMS研究軟件並申請專利。
4研究實踐
方證代謝組學通過利用高精確度的分析技術，結合模式識別、專家係統等分析方法從整體上來探討證候在代謝層麵的特征和規律，使代謝物含量變化與生物表型的改變建立直接關聯，能夠更準確地反映生物體係的狀態，揭示疾病發生發展的代謝機製，發現和篩選生物標誌物，並能為進一步探索治療靶點提供重要信息。代謝產物的變化與髒腑生理、病理密切相關，理應更能反映中醫“證”的本質。方證代謝組學立足生命活動過程整體的“係統性、全局性”的研究思路，充分體現了中醫藥“整體觀念”的理論內核及辨證論治的個體化診療模式。近年來，王喜軍教授領銜的團隊在中醫方證代謝組學研究方麵已經取得一定成果。以中醫方證代謝組學研究方法揭示了黃疸證、腎虛證、實熱證、失眠症、心氣虛證、消渴證、氣陰兩虛證等生物學本質，並闡明相關方劑茵陳蒿湯、六味地黃丸、黃連解毒湯、酸棗仁湯、溫心方、生脈飲及天芪降糖膠囊等方劑治療上述相關病證的整體療效及體內直接作用物質，並闡明方劑的效應機製及配伍的科學意義。
4.1中醫證候研究Wang X J等[18]采用UPLC-TOF-MS技術結合多變量數據分析等統計方法分析心氣虛證尿液內源性化合物，數據顯示心氣虛證組和健康組明顯區分，2組間17個內源性代謝物的含量存在明顯差異並與脂肪酸代謝、膽汁酸代謝、嘌呤代謝、色氨酸代謝異常相關。利用甲狀腺素和利血平誘導複製大鼠腎陰虛模型，使用優化的尿液樣品LC-MS分析方法對不同給藥時間大鼠尿液進行質譜表征，並采用主成分分析的方法對代謝輪廓進行分析評價[19]，結果表明方證代謝組學技術平台可以很好的顯示大鼠腎陰虛模型複製過程中尿液代謝輪廓的變化，采用OPLS-DA分析方法，首次發現了20個潛在生物標記物並作為連接紐帶，找到了標記物與傳統生物信息學的聯係，加深了對腎陰虛證本質的認識。證候相關生物標記物的闡明，為設計複製證候相關的動物模型，開展相關治療藥物的發現研究提供一定方法基礎。張淑香等將方證代謝組學方法與UPLC-TOF/MS及模式識別相結合，建立並驗證“消渴證”大鼠模型[20]，在此基礎上研究“消渴證”代謝特征及生物標誌物。研究發現尿液中12個差異代謝物，主要有古洛糖酸、假脲嘧啶核苷、4-吡啶丁烯酸、對-甲酚葡糖苷酸、硫酸吲哚酚、2，8-二羥基喹啉-β-D-葡萄糖醛酸苷等，涉及糖醛酸途徑，嘧啶核苷途徑和氨基酸途徑。這些差異小分子物質構成“消渴證”的代謝標誌物群，成為消渴證代謝水平的物質基礎，有助於闡釋消渴證的本質。可見基於UPLC-TOF/MS及模式識別的方證代謝組學技術在揭示傳統中醫理論科學價值方麵有著廣泛的應用前景。
王喜軍等通過患者尿液的方證代謝組學分析，建立黃疸證（陰黃、陽黃證）的特征性代謝模式，尋找相關生物標誌物（群），即探尋“證”的物質基礎，並從微觀角度解讀黃疸證候的科學內涵[21]。並建立了不同證型的代謝診斷模型，可基於方證代謝組學研究結果進行中醫的辨證分型。完成了中醫黃疸證及其亞型陽黃證及陰黃證的代謝輪廓及生物標記物研究，發現黃疸證生物標記物44個，包括二甲基鳥（嘌呤核）苷、吲哚穀氨酰胺、皮甾酮四醇-3-葡糖苷酸、孕二醇-3-葡糖苷酸等。首次從代謝角度揭示黃疸證的代謝徑路，即主要關聯於酮體的合成及降解、丙氨酸、天門冬氨酸及穀氨酸代謝、色氨酸代謝、精氨酸及脯氨酸代謝、甾類激素、初級膽汁酸生物合成，D-穀氨酰胺及D-穀氨酸代謝、以及半胱氨酸及甲硫氨酸代謝等。這為闡釋中醫黃疸病證候的生物學本質，及診斷客觀化、規範化和病證分型治療提供了依據；同時也為黃疸證相關動物模型的複製提供了依據。進一步發現陽黃證生物標記物40個，主要關聯於色氨酸代謝，維生素B6代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等；鑒定陰黃證生物標記物49個包括2-丁烯二酸，焦穀氨酸，α-N-苯乙酰基-L-穀氨酰胺等，主要和半胱氨酸和蛋氨酸代謝，初級膽汁酸的生物合成等相關。中醫不同證候之間存在著不同的代謝物組、代謝產物譜或其代謝網路的改變。通過測定不同證候間代謝產物的變化，有可能為中醫證候（病）診斷的客觀化、定量化開辟一條新途徑。通過分析肝鬱脾虛證病人尿液代謝物組研究了肝鬱脾虛證的物質基礎[22]。鑒定了12個差異代謝物，其代謝徑路主要與半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸，氨基糖和核苷酸糖等代謝相關聯。以上差異小分子物質構成“肝鬱脾虛證”的代謝標誌物群，成為肝鬱脾虛證代謝水平的物質基礎。