微囊化成骨細胞誘導骨髓間充質幹細胞體外成骨分化的量效研究
論著
作者：餘可和 盧曉郎 餘 洋 毛誠晃 張敬東
[摘要] 目的 探討微囊化成骨細胞體係細胞添加量對誘導骨髓間充質幹細胞體外成骨分化的影響。 方法 製備含有成骨細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊，與間充質幹細胞的共培養，在1，7，14 d通過細胞增殖量、堿性磷酸酶活性、實時定量PCR等檢測，統計結果並分析。 結果 各時段細胞增量無統計學意義；堿性磷酸酶活性隨細胞濃度增加表現出遞增趨勢，且骨鈣蛋白mRNA的表達結果基本一致。 結論 微囊化成骨細胞在低濃度下已能促進骨髓間充質幹細胞成骨分化，濃度升高時促分化能力越強，但達到一定濃度後繼續提高時，對成骨分化的作用則不再增強。
[關鍵詞] 微囊；成骨細胞；骨髓基質幹細胞；分化
[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0004-01
骨缺損和骨折不愈合是骨科醫生常麵臨的困難，骨組織工程為解決這一問題帶來了希望。骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）作為骨組織工程的種子細胞已獲得了廣泛的認同[1]。骨髓間充質幹細胞是一種具有多方向分化潛能的幹細胞[2]，目前的研究表明BMSCs能夠分化為成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等，不表達共刺激抗原，是一種理想的種子細胞，可以修複受損的人體組織，在組織工程和整形外科等領域具有重要的研究價值[3]。由於人體組織器官結構功能的複雜性，幹細胞在植入人體前應進行體外誘導分化，從而降低臨床應用的危險性[4]。基於上述前提，我們設計了以下的實驗研究。
1 材料與方法
1.1成骨細胞分離培養和鑒定
新生SD大鼠處死後，在無菌條件下，取顱蓋骨，去除軟組織，將骨塊剪成1～2 mm2大小後PBS溶液反複洗滌，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入5 mL胰蛋白酶溶液（濃度為0.25%），37℃ 15 min水浴振蕩消化後加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液終止消化，離心（1 000 r/min，5 min），棄上清液，加入3 mL Ⅱ型膠原酶溶液（濃度1 mg/mL），在37℃水浴消化90 min，離心後除去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液後，用吸管輕輕打散細胞沉澱，製成細胞懸液，接種於25 cm2培養瓶內於37°C，5%體積分數CO2環境中培養。48 h全量換液繼續培養，每3天換1次液，待細胞融合到80%時，吸去培養基，用PBS衝洗2次後用1 mL含有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，加入培養液終止消化，離心加培養液重懸之後，采用差速貼壁法篩選獲取純化的成骨細胞原代。待細胞集落呈70%～80%彙合時開始傳代，傳代3次後進行堿性磷酸酶染色鑒定。
1.2 骨髓間充質幹細胞的分離、培養以及免疫表型、成骨分化潛能的鑒定
采用全骨髓貼壁法分離BMSCs：SD大鼠麻醉後常規消毒，備皮，左側股骨大轉子處作骨髓穿刺術。抽取3 mL左右骨髓置於離心管，PBS衝洗，離心（1000轉/10 min）後棄上清和脂肪，洗滌2次後加入含有標準培養基的培養瓶中，37°C，5%體積分數CO2環境中培養。48 h後換液，以PBS洗滌2次，換上新鮮培養基，繼續培養。每3天換液一次，待到細胞集落呈70%～80%彙合時，開始傳代。
BMSCs的成骨分化潛能的鑒定：取第3代BMSCs接種於放有細胞爬片的6孔培養板，細胞覆蓋達80%，棄去普通培養液，加入含成骨細胞誘導劑的培養液，每3天換液一次，培養2周。成骨細胞誘導劑含β-甘油磷酸鈉10 mM，地塞米鬆10-9 M，抗壞血酸鈉0.2 mM，FBS。經成骨誘導培養2周後取出細胞爬片進行堿性磷酸酶染色鑒定。
1.3 微囊化成骨細胞（OB-APA微囊）的製備和培養以及形態學觀察
1.3.1 微囊化成骨細胞的製備和培養 靜電液滴發生法製備OB-APA微囊：將成骨細胞與15 g/L的海藻酸鈉溶液以體積比1∶10混合均勻，吸入20 mL注射器，在最優製備條件下混入0.1 mol/L CaCl2，海藻酸鈣微球，靜置10 min後除去上清液，生理鹽水洗滌3次，將膠珠投入0.5%聚左賴氨酸震蕩條件下反應5 min，生理鹽水洗滌3次，再用1.5 g/L的海藻酸鈉溶液振蕩5 min，除去上清液並用生理鹽水洗滌3次，再投入55 mmol/L檸檬酸鈉液化5 min，生理鹽水洗滌，即得OB-APA微囊[5]。
1.3.2 微囊化成骨細胞計數 采用機械破囊計數法測定製備的OB-APA微囊中的成骨細胞的量，即采用1 mL無菌注射器，內徑約為330 nm 的3號針頭反複抽吸微囊懸液，使微囊破碎。顯微鏡下觀察以確定細胞已完全釋放，然後采用200目篩網過濾微囊碎片，離心，重懸細胞，使用細胞計數板計數。
1.3.3 微囊化成骨細胞形態學觀察及形態學觀察 製得的微囊化成骨細胞置於培養皿內，使其分散均勻，倒置顯微鏡下觀察其形態。
1.4 實驗分組及設計
將第3代BMSCs 接種於放有爬片的培養皿中，細胞密度為5×106 cells/cm2的密度，加入微囊化成骨細胞，及10%胎牛血清的DMEM培養液。根據成骨細胞與骨髓基質幹細胞的添加量的比值進行分組。A組：15∶1；B組：10∶1；C組：5∶1；D組：1∶1。
1.5 共培養後BMSCs向成骨細胞定向分化的生物學檢測
1.5.1 通過測定DNA含量變化分析BMSCs增殖情況 培養的1、7和14 d，每組取出3個樣本，PBS液衝洗後0℃下在含有EDTA和巰基乙醇的細胞裂解液中消化30 min。得上清液，超聲儀高頻聲波裂解，4℃離心（12 000轉/5 min）。取40 μL的細胞裂解上清液與160 μL的Hoechst 33258染液混合（1 μg/mL）通過稀釋1 mg/mL的牛胸腺DNA獲得標準曲線，對比標準曲線測得DNA的含量，並通過熒光計測量每個樣品的熒光強度。