中國恒河猴SIVmac239艾滋病模型亞急性期的實驗觀察
臨床實驗
作者：陳靜 李茂清 符林春 張清仲 陳劍濤 胡董仁 周紅豔
[摘要] 目的：觀察SIVmac239中國恒河猴艾滋病模型亞急性期內T淋巴細胞亞群、病毒載量指標變化情況，探討中國恒河猴艾滋病模型亞急性期病毒學相關指標變化特征。方法：采用SIVmac239病毒株靜脈接種健康中國恒河猴複製中國恒河猴艾滋病動物模型，觀察猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus， SIV）感染後動物模型亞急性期內T淋巴細胞亞群指標變化、病毒載量變化情況。同時記錄動物模型臨床症狀情況。結果：健康恒河猴接種病毒株後3個月體重及BMI指數比較穩定，各時間點差異不顯著，在感染第10～14天病毒載量達到高峰（6.72±0.44）個lg，此後整體表現為水平波動下降趨勢。T淋巴細胞亞群在感染後出現顯著改變，CD3，CD4，CD8計數和百分比有不同程度的變化；CD4/CD8比值感染後2周內明顯下降，一般在病毒載量高峰時表現為最低比值為（0.86±0.29），隨後比值緩慢波動上升。感染3個月內共有3隻感染猴臨床症狀明顯，其中1隻出現腹瀉、2隻出現攝食下降等臨床症狀。結論：中國恒河猴艾滋病動物模型與國外印度恒河猴艾滋病動物模型亞急性期相似，研究內容為中國恒河猴應用於艾滋病模型研究的標準化建立補充了更詳盡的亞急性期變化內容。
[關鍵詞] 艾滋病；亞急性期；恒河猴；SIV
艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是因機體感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）導致全身免疫係統毀滅性打擊所出現的獲得性免疫缺陷綜合症[1-2]。恒河猴的基因序列、血液生化指標等與人相近[3-6]，感染猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus， SIV）病毒後發病機製、過程、臨床症狀表現與人艾滋病相似[7-9]，可在感染病毒後出現免疫體係的損害和多係統多器官組織的病變，所以猴艾滋病模型成為艾滋病研究的一個金標準，並為WHO所推薦[10]。國外恒河猴猴艾滋病模型多采用印度恒河猴建立。中國恒河猴應用於艾滋病模型在國內雖然較為常見，但對感染亞急性期模型的研究結果報道較少，而且並不詳細，這對中國恒河猴應用於艾滋病模型研究的標準化建立帶來了亞急性期研究內容的缺失。本研究針對SIVmac239感染中國恒河猴亞急性期3個月內各監測指標進行了較為深入的研究。
1 材料與方法
1.1 動物 試驗研究對象為15頭中國恒河猴，雄性，體重4.5～6.5 kg，3～5歲，平均年齡為（3.91±0.67）歲。外觀健康，體檢無淺表淋巴結腫大，經檢測結核菌素試驗陰性和胸部X光片正常，痢疾菌陰性，血清學SIV、猴逆轉錄D病型毒（SRV）、猴B病毒（BV）、猴T淋巴細胞I型病毒（STLV-I）抗體陰性。試驗動物購自廣東省靈長類動物實驗中心。實驗動物合格證明證號SCXK（粵）2009-0025。
1.2 實驗環境 本研究在廣東省長類動物實驗中心進行，實驗場地為生物安全2級實驗室，動物實驗設施檢驗編號C。動物單籠飼養在不鏽鋼籠具中，每天投3次飼料，自由飲水。室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%。
1.3 實驗動物醫學倫理 本實驗經廣東省長類動物實驗中心動物倫理委員會批準（文件編號K09004-IACUC），實驗嚴格按照廣東省長類動物實驗中心標準操作/作業流程執行，並按照K09004-IACUC文件中內容給予相應的動物福利。
1.4 主要試劑與儀器 血常規采用HORIBA ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀分析（由高要市康達公司檢測）；外周血T淋巴細胞亞群檢測采用美國BD公司的FACSCalibur型流式細胞儀，檢測用熒光標記單克隆抗體CD3-別藻藍蛋白（ APC），CD4-多甲藻葉綠素蛋白（PerCP），CD8-藻紅蛋白（PE）均購自美國BD 公司； SIV RNA 抽提采用一管式體液病毒核酸抽提試劑[11]逆轉錄酶、RNA 酶抑製劑、探針法熒光定量PCR 試劑盒均購自立陶宛Fermentas公司； 熒光定量PCR 檢測采用ABI-7300 PCR儀（美國生物係統公司）測定。
1.5 中國恒河猴艾滋病模型 模型建立參照文獻進行複製[12-13]。SIVmac239病毒株，由中國科學院昆明動物研究所鄭永唐博士饋贈，廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所保存。病毒滴度為5.0×105組織半數感染量（TCID50）/mL，動物以氯胺酮7 mg·kg-1麻醉後以5MID100（100%感染劑量）經靜脈注射1 mL感染動物。感染後2周，以血漿病毒分離陽性證實病毒感染模型成功。
1.6 艾滋病中國恒河猴動物模型亞急性期複製研究方案 挑選檢疫合格的健康合格中國恒河猴，靜脈接種SIVmac239病毒株複製中國恒河猴艾滋病模型。檢測感染0，3，7，10，14，17，21，24，28 d，6，10周，3個月血常規及病毒載量變化；檢測感染0，14，28 d，6，10周，3個月T淋巴細胞亞群變化情況。
1.7 觀察指標 根據試驗方案對以下指標試驗時點進行監測。
臨床症狀觀察指標如下。采食觀察：食欲是否正常，有無挑食、拒食現象，是否有啃籠具、吃糞便現象。精神狀態：有無萎靡不振、垂頭抱腹、躺臥等現象；有無精神狂躁、抽搐、運動失調、四肢癱瘓等症狀。糞尿情況：觀察糞便的顏色、形狀、氣味、排糞次數、含水量、糞便數量，糞便是否膿血便、水樣便、粘液便、帶有腐味的稀糊狀糞便。觀察排尿次數、每次排尿量及顏色等。同時觀察有無嘔吐、口渴、腹脹、脫肛等。皮膚被毛：有無咬傷、創傷、被毛蓬亂、被毛缺損和脫毛等；有無水皰、丘疹、脫水皺縮，四肢關節有無腫脹等現象。
SIV病毒感染相關指標如下。於早8點采集空腹16 h恒河猴靜脈EDTA-K抗凝血4 mL，HORIBA ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀分析血常規（由廣東省長類動物實驗中心檢測）；BD FACSCalibur流式細胞儀分析T淋巴細胞亞群，檢測以CD3，CD4，CD8熒光標記；熒光定量PCR法測病毒載量，以100 μL血漿中提取的RNA為模板經逆轉錄後ABI-7300 PCR儀測定，定量 PCR 探針序列為：FAM-TGCGTAACACCCGAACCAGGAATCTCAGC-TAMRA，引物序列為：上遊引物 CTTGGACTGA-CATTTAGCGTAGC；下遊引物 GCCACAT-GCTTTCATTTAAGTACG。反應條件為： 95 ℃，10 min 預變性，然後以95 ℃，15 s，60 ℃，1 min 進行45個循環，采用定量 PCR 儀自帶軟件分析定量。並將實際檢測結果取lg值後比較。
1.8 統計學處理 分析用SPSS 17.0統計軟件，計量資料用表示，不同時間點指標比較采用配對t檢驗。校驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 中國恒河猴艾滋病模型亞急性感染期內血常規、病毒載量變化情況 對中國恒河猴艾滋病模型亞急性感染期3個月內血常規、病毒載量變化情況分析表明：WBC，LYM%，NEU%在感染3個月內出現水平波動。病毒載量在第10～14天達到高峰，隨後病毒載量出現波動下降趨勢，在感染第10周下降至均數最低水平。淋巴細胞百分比與病毒載量對數變化較為一致。
2.2 中國恒河猴艾滋病模型亞急性感染期內T淋巴細胞亞群變化情況 感染3個月內，CD3，CD4，CD8計數，CD3%，CD8%均不同程度升高，差異均有統計學意義（P﹤0.05）；CD4%，CD4/CD8值均不同程度降低，其中CD4%感染3個月與感染0周比較，CD4/CD8值感染2周、10周、3個月與0周比較，差異均有統計學意義（P[14]。本動物模型感染SIVmac239病毒後，病毒載量迅速上升，在感染第10～14天達到高峰，隨後出現波動下降趨勢，在感染第10周下降至均數最低水平。整個過程具有明顯的病毒高峰期，約在10周左右進入病毒平台期。