NGR多肽修飾的脂質體及其抗腫瘤研究進展
綜述
作者：王詠，陳軍，林愛華，方芸
[摘要] NGR多肽是一種能與腫瘤新生血管內皮細胞上的CD13受體結合的靶向肽。將NGR多肽與脂質體相連接，得到NGR多肽修飾的脂質體。通過靜脈注射該脂質體，NGR多肽能與腫瘤新生血管上的CD13受體結合，將脂質體定位於腫瘤組織，使得脂質體中的藥物濃集於腫瘤部位，從而提高抗腫瘤效果。該文從NGR多肽入手，對NGR多肽的定義、NGR多肽修飾的脂質體、NGR多肽修飾的脂質體抗腫瘤的優勢和不足、NGR多肽修飾的脂質體的最新研究方向等進行了綜述，並對NGR多肽修飾的脂質體未來的研究進行了展望。
[關鍵詞] NGR多肽；NGR多肽修飾的脂質體；CD13受體；抗腫瘤
脂質體是一種結構和組成類似於生物膜的超微型藥物載體。由於脂質體具有生物相容性、細胞親和性、靶向性等性質，使其在抗腫瘤方麵具有廣泛的應用。脂質體可以通過增強滯留效應（enhanced permeation and retention effect，EPR）被動進入腫瘤組織，相比於單純的放化療，具有一定的臨床治療優勢[1-2]。但由於血流速度較快，脂質體通過靜注進入體內後並不能長時間停留在腫瘤部位，而在脂質體表麵連接多肽製備成的靶向脂質體靜脈注射後能立即到達靶部位，能較長時間停留在腫瘤部位，藥物從脂質體中釋放出來，能提高腫瘤治療效果。因此，抗腫瘤主動靶向脂質體已經成為研究熱點之一。主動靶向脂質體包括免疫脂質體、受體介導脂質體、糖基修飾脂質體等。
本文從NGR多肽入手，對NGR多肽的定義、NGR多肽修飾的脂質體、NGR多肽修飾的脂質體的抗腫瘤優勢和不足、NGR多肽修飾的脂質體的最新研究方向4個方麵對NGR修飾脂質體進行綜述。
1 NGR血管靶向肽
1.1 NGR多肽以及表達氨肽酶（CD13）
NGR多肽即含天門冬酰胺酸-精氨酸-甘氨酸（asparagine-glycine-arginine）序列的多肽，1998年，Arap等[3]用噬菌體展示技術篩選到具有腫瘤新生血管靶向性的天門冬酰胺酰精氨酰甘氨酸短肽，它能特異性地與CD13的細胞結合。CD13是一種跨膜金屬蛋白酶，具有多種功能，如調節機體自身免疫力和細胞因子的表達，降解基質膜，激活某些信號轉換通路，細胞遷移和血管生成等[4-7]。CD13是血管生成的重要調節因子，正常血管內皮細胞上的CD13未被激活，而在腫瘤新生血管的內皮細胞上，CD13高度表達[4，8-9，12-15]。研究發現，NGR不僅能夠靶向於腫瘤新生血管內皮細胞，還能夠靶向於病理或者生理狀態（如炎症和視網膜疾病）下活化的血管內皮細胞[10-11]。
1.2 NGR多肽的種類及比較
NGR多肽的種類有很多，一般分為直鏈狀和環狀2種。直鏈狀的NGR多肽有CYGGRGNG，CNGRCVSGCAGRC，GNGRGGVRSSSRTPSDKYC等。環狀的NGR多肽有KNGRE，GGCNGRC，CNGRC等。環狀NGR多肽的成環方式有2種，一種是首尾通過酰胺鍵成環，另一種是如果分子中有2個巰基，則可通過巰基之間形成二硫鍵成環。與直鏈多肽相比較，環狀多肽腫瘤靶向性更高。文獻研究表明，盡管直鏈NGR多肽與藥物相連接已經顯示了抑製腫瘤的活性，但是環狀NGR與藥物相連後抗腫瘤活性比線狀高10倍[12]。研究報道，環狀KNGRE類似物與CD13的粘連能力比其鏈狀的要高4倍[16]。
1.3 NGR多肽修飾的生物大分子
NGR多肽可以與腫瘤壞死因子（TNF）、幹擾素（IFN）、病毒等相連接，靶向性地將藥物帶入腫瘤血管中，抑製腫瘤新生血管生成，抑製腫瘤生長，從而達到抗腫瘤的目的。文獻報道，將NGR多肽與腫瘤壞死因子相連接，可以將藥物帶入腫瘤血管，NGR-TNF的抗腫瘤效果比單獨使用TNF強30倍[14，17]。Pastorino等[18]將NGR連接到包載有多柔比星的脂質體上，並將該脂質體注射入以常位神經細胞瘤細胞為模型的免疫缺陷性小鼠體內，結果發現與普通脂質體相比，NGR多肽修飾的脂質體在腫瘤部位的積聚提高了10倍。Curnis等[19]在IFN不敏感的鼠腫瘤模型中，將多肽GCNGRC和IFNγ結合在一起，結果發現在GCNGRC的配合下，微量的IFNγ可以延緩腫瘤生長，劑量僅為臨床常用量的1/500，而這種模型對單獨使用IFNγ無效。NGR多肽同時可以用於病毒的載體修飾，Grifman等[20]研究發現，帶有線性和環狀NGR多肽的腺相關病毒能靶向地感染表達CD13的細胞。將NGR多肽插入腺病毒纖維蛋白或者殼粒蛋白中可有效輸送血管他丁到內皮細胞並抑製增殖、誘導凋亡[21]。
2 NGR多肽修飾的脂質體
2.1 NGR多肽修飾的脂質體的製備
多肽修飾脂質體的製備方法一般有2種：一種是將活化的DSPE-PEG-MAL（PEG修飾劑，常用的還有DSPE-PEG-NHS，DSPE-PEG-BTC）與成膜材料混合製備脂質體，然後加入導向化合物與活化的MAL反應，使之偶聯在脂質體表麵[16]，另一種是先將多肽與活化的DSPE-PEG-MAL偶聯，然後將偶聯產物與脂質體混合攪拌，靠DSPE端的疏水性相互作用使導向化合物連接到脂質體表麵[23]。Fabio[27]用HSPC-CHOL-DSPE-PEG2000-DSPE-PEG2000-MAL 2∶1∶0.08∶0.02摩爾比的磷脂材料，混合溶於有機溶劑中，用氮氣吹幹成膜，用25 mmol的HEPES和140 mmol的NaCl緩衝液水合（pH 7.4），製備得到空白脂質體。用0.2～0.8 μm的聚碳酸酯膜擠出。再將NGR多肽與製備得到的脂質體等摩爾混合，在4 ℃放置16 h，得到NGR靶向脂質體。Chen等[29]用EPC-CHOL-DSPE-PEG-DSPE-PEG-GGCNGRC 20∶10∶1∶1摩爾比的磷脂材料溶於氯仿中，旋轉蒸發成膜，加入123 mmol的pH 5.4的硫酸銨溶液，水浴超聲30 min，所得到的脂質體用80 nm的聚碳酸酯膜在50 ℃擠出11次，擠出後用葡聚糖凝膠柱純化脂質體。有文獻報道[22]用第2種方法製備多肽修飾的脂質體較好。優點是防止製備脂質體時超聲對多肽活性和活化的DSPE-PEG-MAL的破壞，提高了DSPE-PEG-MAL的利用率，保護了多肽的生物活性。
2.2 NGR多肽與DSPE-PEG2000的連接
NGR多肽修飾脂質體的製備是先將NGR多肽與製備脂質體所需的隱形材料DSPE-PEG連接，製備得到DSPE-PEG2000-NGR，再將其與磷脂材料按一定的比例混合，最終製備得到NGR靶向脂質體。因此，NGR多肽與DSPE-PEG2000連接的數量直接影響到脂質體表麵的NGR的密度，影響到脂質體的腫瘤靶向性。研究表明，多肽與DSPE-PEG的連接是通過DSPE-PEG端活潑酯與多肽的α-氨基之間反應進行的[24]。常見的活潑酯類有-MAL，-NHS，-BTC等。DSPE-PEG-MAL與某種NGR多肽的化學反應式。
2.3 NGR多肽與DSPE-PEG2000耦聯率的測定
由於NGR多肽與DSPE-PEG2000的連接數量影響到脂質體靶向的效率。因此，有必要測定NGR與DSPE-PEG2000的耦聯率。NGR多肽與DSPE-PEG2000耦聯率的測定可以通過儀器分析方法來測定。例如可以用透析法根據分子量的差異來分離偶聯與未耦聯的脂質體，再利用質譜、高效液相、核磁共振等來測定。Takara等[25]在試驗中用DSPE-PEG-MAL與GNGRGGYC反應製備DSPE-PEG-GNGRGGYC，其耦聯率是通過MALDI-TOF-MS檢測DSPE-PEG-GNGRGGYC的相對分子量來測定。Michael等[26]在試驗中用DSPE-PEG-MAL與GNGRGC以1∶1摩爾比的量在4 ℃反應20 h製備DSPE-PEG-GNGRGC，耦聯率用UPLC-ELSD（蒸發光散射檢測器）來測定。Fabio等[26]用DSPE-PEG-MAL與GNGRGGVRSSSRTPSDKYC反應製備DSPE-PEG-GNGRGGVRSSSRTPSDKYC，用CBQCA protein quantification kit來測定耦聯率。CBQCA是一種用於氨基酸，多肽及蛋白質檢測的熒光衍生試劑。CBQCA本身無熒光，但是在弱堿性的條件下，與氨基酸、多肽或者蛋白質的伯氨基反應後，生成穩定的強熒光異吲哚衍生物，再用HPLC測定氨基酸，多肽以及蛋白的含量。
2.4 多肽靶向脂質體的表麵配體修飾密度研究
多肽修飾的靶向脂質體，其靶向配體分子在脂質體表麵修飾的密度對脂質體本身的特性及其體內靶向效果有很大影響。周正源等[27]采用孵育插入法將帶有多肽的脂質分子插入脂質體表麵，用分子篩色譜分離修飾後的脂質體和未插入的多肽脂質，再用HPLC-ELSD定量分析各種成分，得到多肽靶向脂質體的靶向肽密度。然後將修飾有不同密度靶向多肽的熒光脂質體經荷瘤小鼠尾靜脈注射，分別在給藥前後各時間點對小鼠掃描，計算AUC，T1/2，MRT。結果表明，隨著脂質體表麵多肽的密度增加，當多肽密度大於1.298%時，小鼠腫瘤部位的AUC，T1/2，MRT都比未修飾的脂質體有所提高。說明其在腫瘤組織中的聚集量增多，停留時間延長，腫瘤細胞的特異性機製更加明顯。
2.5 NGR多肽修飾的脂質體抑製腫瘤生長的機製
NGR多肽修飾的脂質體是通過與腫瘤新生血管內皮細胞間的受體-配體結合作用來抗腫瘤的。其抗腫瘤機製可以概括為2方麵的內容。一，由於腫瘤組織的生長依賴於新生血管的生成，新生血管不僅可以提供腫瘤生長所需的營養和氧氣，排泄代謝產物，而且是腫瘤轉移的重要途徑，將NGR多肽修飾的脂質體通過靜注進入體內後，能迅速到達腫瘤部位，通過與新生血管內皮細胞上的CD13相結合，能停留於腫瘤新生血管上，抑製了腫瘤新生血管的生長和轉移，間接達到抗腫瘤效果；二，由於NGR多肽修飾的脂質體能夠停留在腫瘤部位，藥物能夠緩慢從脂質體中釋放出來，降低藥物在血管中循環的時間，提高腫瘤部位藥物的聚集，從而提高藥物抗腫瘤的療效。
3 NGR多肽修飾的脂質體的靶向性評價方法
3.1 體內活體成像——CT在體成像
CT成像技術是利用X-射線對人體或者動物某部位一定厚度的層麵進行掃描，取得信息，經計算機處理而獲得的斷麵解剖圖像。利用CT成像技術可以直觀觀察脂質體在腫瘤部位的分布以及定量分析腫瘤組織中脂質體的含量。Michael等[26]將H520肺癌細胞置於RPMI1640培養液中培養，然後接種於小鼠體內，當腫瘤在小鼠體內長至50 mm3時，於小鼠尾靜脈注射包載碘海醇的NGR靶向脂質體，給藥後用2%異氟醚使小鼠吸入麻醉並解剖，進行CT掃描，觀察注射前和注射後8，24，48，72，96，144 h的圖像，圖像控製在15.7 cm×10.2 cm下觀察。
3.2 細胞靶向性實驗
3.2.1 流式細胞實驗 細胞攝取實驗一般是利用流式細胞儀來測定，選擇一種具有熒光性質的物質（可以是具有熒光的藥物）作為標記物，一般常用的標記物有多柔比星、鈣黃綠素。將標記物包封於靶向脂質體中，再與表達有CD13的細胞共同孵育，放於流式細胞儀下觀察，通過觀察流式細胞儀中的熒光強度，來定性說明NGR脂質體的靶向性。Chen等[25]將HUEVC細胞在一個6孔板中孵育24 h（37 ℃，5%CO2），將多柔比星遊離溶液，多柔比星普通脂質體，NGR靶向多柔比星脂質體分別加入其中，共孵3 h，將細胞消解，用PBS清洗細胞，立即放在流式細胞儀上分析，流式細胞儀測定與細胞結合的標記物的熒光強度。熒光強度越大，表明與細胞結合的脂質體越多，脂質體的靶向性越強。常用於靶向性實驗的細胞有HUEVC（人臍靜脈內皮細胞），TE細胞，MS-1細胞，HT-1080細胞。