五味子多糖提取分離和藥理作用研究進展
綜述
作者：陸兔林 吳楊 季德 周淵 毛春芹
[摘要] 近年來五味子多糖的研究取得了很大進步，該文綜述了五味子多糖的提取、純化、分級、含量測定、結構解析的方法和技術，及其所具有的保肝、抗腫瘤、增強免疫、抗衰老、抗疲勞、抗變態反應等藥理作用。五味子多糖具有較強的藥理活性，但多糖的提取、純化效率仍不高，功能活性測定大部分是在五味子粗多糖的基礎上進行的，其作用機製尚需深入探討。
[關鍵詞] 五味子；多糖；提取；純化；藥理作用
五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.的幹燥成熟果實，習稱“北五味子”，是著名滋補性中藥，始載於《神農本草經》，列為上品。中醫理論認為，五味子性酸、甘、溫，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之功效 [1]，化學成分主要有揮發油、木脂素、有機酸、多糖、氨基酸、無機元素等[2]。早期的研究多集中在脂溶性成分方麵，但傳統用藥習慣以及許多五味子水提液的顯著藥理活性實驗，均提示五味子的水溶性成分研究不可忽視。近年來，許多學者從五味子水提液中分離得到五味子多糖，並對其活性進行了深入研究。現將五味子多糖的研究近況進行概述，以期對五味子多糖的研究、開發和利用提供參考和借鑒。
1 提取工藝
根據多糖溶於水的性質，一般采用熱水浸提，乙醇沉澱的方法。可以直接提取，也可先以石油醚、無水乙醇或其他有機溶劑脫脂後再進行提取。多糖受提取溫度、時間、溶劑量、提取次數等因素影響呈現不同的提取效果，多項研究表明，溫度是影響五味子多糖得率的最重要因素[3]，可依據具體情況確定最佳提取工藝。由於堿性物質能打斷植物細胞壁中纖維素、半纖維素與木脂素之間連接的酯鏈，溶解與細胞壁多聚糖結合的酚醛酸、糖醛酸，而且酸性條件可能致使糖苷鍵斷裂，因此，加堿能夠大幅提高五味子多糖的提取率[4]。研究表明，采用稀堿法可顯著提高對五味子多糖的提取率，是水提法的1.12倍，堿水法的1.06倍 [5]。在熱水浸提的基礎上采用超聲波、微波進行輔助提取是對傳統提取方法的一種改進，可有效提高提取率，縮短提取周期，減少溶劑用量[6]。另外，采收期和生長環境也是影響北五味子中多糖含量的重要因素 [7]。
酶技術是近幾年廣泛應用與活性成分提取的一項生物技術，常壓條件下所用的酶有蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等。在酶作用下，植物組織分解後，可加速多糖的釋放和提取。比較酶法提取與傳統水提法，發現酶法的平均提取率比水法提高16.79% [8]。近年來，越來越多的新技術方法應用與有效部位的提取分離，除上述方法外，還有學者應用超濾法[9]、半仿生法[10]提取五味子多糖。采用不同的提取工藝，對粗多糖的提取效果會產生影響，表1為各方法提取多糖的優缺點比較。
2 分離純化
采用水提醇沉法得到的多糖粗製品中，一般含有無機鹽、蛋白質、低相對分子質量的有機物等許多雜質，為進一步研究多糖提供較純的物質原料，因此必須要對粗多糖進行純化。純化主要包括脫蛋白、脫色、透析和分級等步驟。
2.1 脫蛋白 常采用的方法有Sevag法、三氯乙酸-正丁醇法、酶法以及酶法與Sevag聯用法等。三氯乙酸法操作較為簡便，而Sevag法條件更溫和，有時為達到更好的分離純化效果，也將幾種方法聯合使用，目前最常用的是Sevag法。
2.2 脫色 五味子多糖脫色常用的方法有活性炭、過氧化氫、聚酰胺和大孔樹脂等法。其中顆粒活性炭對多糖吸附較多，雙氧水脫色易對多糖結構造成破壞，必須嚴格控製脫色條件，大孔樹脂吸附法適合小分子物質，用於純化多糖易使多糖活性降低[14]，聚酰胺脫色效果較為理想[13]。
2.3 除小分子雜質 去除多糖中所含的遊離氨基酸、單糖等小分子水溶性成分最常用的是透析法。將多糖提取液置於透析袋中，逆向流水透析。該方法的關鍵之處在於選擇規格適宜的透析膜，既能去除小分子，又盡可能地減少樣品損傷。 目前，用連續透析儀是較為方便的方法。
2.4 純化分級 經過除雜後的多糖仍是混合物，其化學組成、聚合度、分子形狀等具有不均一性。要得到均一的多糖組分，需對該混合物進行分級。
沉澱分級法：多糖溶液屬於多分散係物質，由於多糖類化合物均難溶於有機溶劑，初步純化時可采用不同濃度的乙醇使多糖分級。楊婷婷等[15]將五味子粗多糖配成1%左右的溶液，逐步滴加無水乙醇，當乙醇達12%，20%，30%，36%時出現明顯沉澱，離心去除液體，共獲得4個多糖級分。韓學忠[16]采用恒溫沉澱分級法將精製五味子多糖樣品分成5級，藥理實驗證明有藥效作用的多糖都集中在乙醇40%沒有沉澱下來的部分。
柱色譜法：為從五味子粗多糖提取物中得到均一組分，尚需對其進行進一步純化。主要方法有離子交換樹脂和凝膠柱色譜等。離子交換柱色譜適合於分離各種酸性、中性黏多糖，是目前多糖純化中應用最廣的方法之一，常用交換劑為DEAE纖維素。趙婷[17]將脫蛋白、透析過的五味子多糖樣品通過DEAE-纖維素交換樹脂色譜柱，依次用蒸餾水、不同濃度的NaCl水溶液洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，得到5個多糖組分，各組分的峰形比較對稱。凝膠柱色譜實際上起分子篩作用，是目前植物多糖最常用的高級純化方法，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose），以不同濃度的鹽溶液和緩衝溶液作為洗脫劑，從而使不同相對分子質量的多糖分子得以分離純化。叢娟等[18]將五味子粗多糖經脫蛋白、脫色、Sephadex G-75和Sephadex G-100凝膠柱層析後，得到2種均一多糖。需要注意的是，在多糖的分離純化中，一種方法不能一次性獲得均一組分，綜合利用幾種方法才能達到純化的效果。實質上，分離與純化是很難明顯區別開來的，因為有時在分離過程已在純化了，反過來有的在純化過程中可以進一步得到分離。
3 定量分析方法
多糖的檢測方法可分為兩大類[19]，一是利用組成多糖的單糖的性質進行測定，其中利用單糖縮合反應而建立的方法最多，如比色法、滴定法；二是直接測定多糖，如高效毛細管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜法和酶法。第二類方法需要昂貴的儀器和多糖的純品，且需要特定的酶。
3.1 比色法 該方法需用上述方法將五味子多糖從植物中提取分離出來，然後顯色、比色測定。根據多糖在硫酸作用下水解成單糖分子，並迅速脫水生成糠醛衍生物這一性質，將其與蒽酮或苯酚縮合成有色化合物，在適當波長下比色測定[20]。比色法因操作簡單，試劑容易獲得而被廣泛采用，但此法也存在著較為明顯的缺陷：首先，這種方法僅以某種單糖為對照（通常是葡萄糖），然而植物多糖大多是雜多糖，僅用一種單糖作為參照不確切；其次，顯色試劑不專屬，凡是在酸性條件下能被水解為還原性單糖的成分，如寡糖、糖苷等，均可脫水形成糠醛，進而與顯色劑縮合產生有色物質而幹擾測定。鄭小亮等[21]使用改良的苯酚-硫酸法可以大大地減少誤差，精密度、穩定性和加樣回收率也較為理想。
3.2 儀器分析法 高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）在分析多糖結構中具有快速、 高分辨率和重現性好等優點，近年來使用廣泛。趙婷[17]將分級後的五味子多糖各組分經高效凝膠滲透色譜分析，發現均一單一峰，證明各多糖組分為均一組分。高效液相色譜法也是多糖分析的重要手段之一，尤其是近年來蒸發光散射檢測器（ELSD）作為一種新型的通用檢測器，對揮發性組分和難揮發性組分都能產生響應，可用於多糖的直接檢測。汪豔群[13]以混合單糖為對照品，將五味子多糖經過衍生化處理後進行HPLC分析，實驗條件為柱溫30 ℃，檢測波長250 nm，流動相為0.1 mol·L-1磷酸鹽緩衝液-乙腈（體積比83∶17），流速1 mL·min-1，結果表明，五味子多糖含有Man，Rha，Glc，Ara；各單糖摩爾比為 Man-Rha-Glc-Ara 3.6∶2.25∶9.08∶1。