單克隆抗體在黑素瘤診斷中的作用
綜述
作者：熱依拉·莫合塔爾 康曉靜
惡性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是原發於皮膚的高度惡性腫瘤，是目前發病率增長最快的惡性腫瘤之一，所以早期診斷和及時治療顯得尤為重要[1]。腫瘤標記物可由腫瘤細胞產生或由非腫瘤細胞，如與腫瘤有關的免疫係統產生，可存在於細胞內或細胞表麵[2]。因血清腫瘤標記物的檢測簡便易行，所以在腫瘤學中的應用日益廣泛，但在黑色素瘤中大多數血清腫瘤標記物的敏感性和特異性均不高，且大多數在疾病晚期才高表達，因而不適於早期和亞臨床期[3]。新的黑素瘤生物標記物的發現及其臨床應用價值的研究具有重要意義，可為黑色素細胞瘤建立一種更加準確的具有治療意義的腫瘤分期和分類方法[4]。
1 免疫組織化學在黑素瘤診斷中的作用
1.1 黑素瘤診斷中存在的問題及解決方案：盡管大多數黑素瘤通過臨床表現、組織病理檢查即可診斷，但仍然有部分的原發黑素瘤和轉移性惡性黑素瘤難以診斷及識別其組織來源，需要借助免疫組織化學幫助診斷。抗黑素瘤相關抗原單克隆抗體因此成為輔助診斷惡性黑素瘤的有力工具，即便是以無色素性黑素瘤為表型的黑素瘤也不例外。
1.2 抗黑素瘤相關抗原抗體在診斷黑素瘤中的作用：S-100蛋白（S100 proteins，S-100）是一種鈣結合蛋白，抗S-100蛋白抗體對黑素細胞和黑素瘤染色靈敏性高，但特異性不高，人類黑色素瘤-45（Human Melanoma Black-45，HMB-45）識別黑素小體特異性糖蛋白GP100對黑素細胞有很高的特異性[5]。但其應用受染色異質性和靈敏性較S-100差的限製，且假陰性率高達35%，黑素A（MelanA）/ 黑素瘤抗原-1（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART-1）和酪氨酸酶（Tyrosinase）在轉移性黑素瘤中也有10%～15%不表達相反，敏感的標記物小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），存在許多亞型並在其他組織中表達，因此，陽性結果不一定反映黑素瘤。故此，不能單獨應用某一種抗體診斷黑素瘤。所以，到目前為止還沒有在靈敏性和特異性上都令人滿意的抗體[6-7]。
2 PNL2的基本性質
2.1 PNL2的性質：Rochaix等[8]於2003年首次提出PNL2可作為黑素瘤細胞標誌物。接著Kurotaki等[9-10]證實PNL2蛋白對人類和白化鼠黑素瘤具有診斷價值，可PNL2蛋白的基因組研究、確切作用機製及過程尚未發現。
2.2 PNL2單克隆抗體的製備：Rochaix等[8]指出PNL2單克隆抗體的製備，是在BALB/C（人源化小鼠的代號）小鼠腹膜內注射耦合類人生長抑素受體2與穀胱甘肽S-轉移酶C末端部分的重組蛋白後，經過一段時間免疫克隆產生的抗體。非免疫球蛋白產生的骨髓瘤細胞係P3×63 Ag8-653也作為配偶體，經過標準技術參與PNL2單克隆抗體的產生。並通過人胰腺和扁桃體的冰凍切片的ELISA活性和間接免疫過氧化物酶方法的聚鏈反應測試出上清液中的抗體。最後根據製造商的協議使用同係小鼠單克隆抗體分型試劑盒進行同種型抗體鑒定。
3 PNL2在黑素瘤診斷中的作用
3.1 不同物種的PNL2蛋白與黑素瘤的關係：Kurotaki等[9]研究表明，PNL2可作為診斷人類、小鼠和白化鼠黑素瘤的標誌物，得出PNL2是最近產生的單克隆抗體（mAb）識別正常和腫瘤黑素細胞，但PNL2識別的抗原目前仍未發現。Giudice等[11]首次采用PNL2來檢測犬黑素細胞抗原。通過對PNL2在犬黑素瘤免疫反應進行測試（4例犬的原發性黑素瘤，2例為口腔黑素瘤，2例為甲床黑素瘤），並與Melan A進行比較。並采用正常的犬組織和非黑素瘤作為陰性對照，對犬黑素瘤的冷凍樣品進行福爾馬林固定、石蠟包埋後通過Western blot分析黑素細胞與PNL2和Melan A免疫反應性。Western blot檢測證實犬黑素瘤中PNL2抗體蛋白的存在。PNL2免疫組化染色的犬黑素瘤細胞胞漿內出現顆粒狀花紋。在所測試的黑素細胞腫瘤，PNL2陽性率為62.0%，Melan A為59.0%；兩種單克隆抗體染色皆陽性50.7%。這兩種抗體染色至少有一種抗體陽性的例數占68.0%。使用PNL2染色顯色範圍比Melan A更大。類似人類粒細胞，犬粒細胞的黑素瘤的PNL2染色分別采用Western blot和免疫組化分析均為陰性。可見，PNL2單抗在福爾馬林固定的犬黑素細胞腫瘤的識別中仍然是一個有價值的診斷試劑。犬和人類黑素瘤中提取物與PNL2的免疫染色顯示類似的結果，這表明人和犬這兩個不同的物種的黑素細胞中存在能與PNL2反應的相同蛋白質。人的粒細胞也能與PNL2反應，其結果是與以往Rochaix等[8]發表的結論一致，但狗粒細胞卻沒有參與PNL2單克隆抗體交叉反應。這研究表明在狗中分布著與人不同的PNL2蛋白質。
3.2 PNL2與原發性黑素瘤和特殊非黑素瘤：Rochaix等[8]首次提出PNL2是一種新的單克隆抗體、主要針對抗黑素細胞抗原。他們研究發現，PNL2免疫染色標記廣泛應用於正常或惡性人類組織和各種黑素細胞病變範圍的分析，有很高的特異性。給予皮膚和口腔黏膜黑素細胞的細胞質和粒細胞染色時，PNL2顯示高濃度。在不同的痣組織學類型，如：皮內痣、表皮痣和混合痣，PNL2染色大多數都是陰性，隻有散在分布的痣細胞在其真皮乳頭層才能被標記。標記原發黑素瘤時，不管黑素瘤的組織學類型分型如何，PNL2的陽性率都在70%以上。Busam等[12]分析PNL2在各種正常組織、黑素細胞痣、原發黑素瘤以及非黑素瘤，包括黑素瘤的組織學類癌以及血管肌脂瘤，並檢測不同的腫瘤類型派生的多種細胞係的免疫反應性。他們采用傳統的石蠟組織切片和幾種組織微陣列板，檢測PNL2、Melan A/MART-1（A103）、Tyrosinase（T311）、HMB-45（GP100）和MITF（D5）在黑素瘤中的免疫反應。PNL2陽性染色出現在正常黑素細胞、嗜中性粒細胞及黑素細胞病變良性痣以及原發性惡性黑素瘤尤其是上皮樣的變體，均常用免疫陽性，但不包括其他正常的細胞類型。除了血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和惡性異型外周神經鞘瘤（屬於惡性Triton腫瘤）這三種非黑素瘤的PNL2的免疫染色陽性，其餘非黑素瘤均為陰性。因此，他們都得出PNL2可作為黑素瘤診斷的補充試劑。