基於大孔吸附樹脂純化技術比較不同產地鐵棒錘中總生物堿與烏頭堿的含量
製劑與炮製
作者：林麗 魏學明 王延惠 晉玲 賀正陽 杜弢 陳紅剛
[摘要] 目的：優選大孔吸附樹脂純化鐵棒錘總生物堿的最佳條件，比較不同產地鐵棒錘中總生物堿與烏頭堿的含量，為進一步研究鐵棒錘質量提供依據。
方法：采用正交設計優選大孔吸附樹脂對鐵棒錘總生物堿的最佳純化條件，以滴定法測定總生物堿的含量。采用最佳工藝條件對4個不同產地鐵棒錘的總生物堿進行純化，並用HPLC測定烏頭堿的含量。
結果：不同工藝條件對總生物堿的純化有不同影響。最佳純化條件為樹脂型號HPD，722，80%乙醇，乙醇洗脫量80 mL·min-1。HPLC測得青海、馬銜山、寧夏、永登4個不同產地鐵棒錘中烏頭堿質量分數分別為0.493 5，0.883 5，1.527 8，1.664 4 mg·g-1。
結論：該文的最佳工藝條件可用於總生物堿和烏頭類生物堿的純化。不同產地鐵棒錘中烏頭堿含量以甘肅永登栽培最高。
[關鍵詞] 大孔吸附樹脂；鐵棒錘；總生物堿；烏頭堿；高效液相色譜法
鐵棒錘為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum szechenyianum Gay.和伏毛鐵棒錘A.flavum Hand.，Mazz的塊根，《中華人民共和國衛生部藥品標準（藏藥）》[1]第一冊以“鐵棒錘”一名收錄，是甘、青、寧、藏等地應用較廣的一種民間草藥，具有活血祛瘀，祛風濕，止痛等作用[2]。蘭州醫學院曾將其塊根製成注射液，鎮痛效果明顯[3]。近年來，隨著鐵棒錘藥用價值的發現，其開發利用研究[4，6]倍受關注，但目前尚未有人采用大孔吸附樹脂對鐵棒錘總生物堿與烏頭堿的純化進行研究。大孔吸附樹脂是一類有機高聚物吸附劑，近年來開始用於中藥有效成分的提取分離和複方製劑中雜質的去除[7，14]。為了充分開發利用這一藥用植物資源，闡明其中的活性物質，本文采用正交設計法優選出大孔樹脂對鐵棒錘總堿的最佳純化條件，並在最佳條件下，純化甘肅永登、馬銜山、寧夏、青海4個產地鐵棒錘的總生物堿，用滴定法測定4個不同產地鐵棒錘總生物堿含量，以HPLC法測定烏頭堿的含量，為鐵棒錘的進一步研究提供依據。
1 材料
Agilent 1200高效液相色譜儀；ZORBAX Edipse XDB，C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；G二極管陣列檢測器；BS224S電子天平。烏頭堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，，）；甲醇、乙腈為色譜純；大孔吸附樹脂型號分別為AB，8，HPD，722，D101，均購於滄州寶恩化工有限公司；其他試劑均為分析純。
甘肅馬銜山野生鐵棒錘采集於馬銜山；甘肅栽培鐵棒錘采集於甘肅省永登縣武勝驛鎮聶家灣村；寧夏野生鐵棒錘購於固原醫藥公司，產地六盤山；青海野生品購於青海三江寶藥業有限公司。以上藥材經甘肅中醫學院藥學係晉玲副教授鑒定，均為毛茛科植物鐵棒錘A.pendulum的幹燥塊根。
2 方法與結果
2.1 樣品溶液的製備
精密稱取鐵棒錘藥材粉末135 g，置於燒杯中，加水浸泡0.5 h，60 ℃，40 Hz超聲提取2次（第1次藥材質量與水體積比為1：24，提取2 h；第2次藥材質量與水體積比為1：20，提取1.5 h）。水煎液離心後合並，放置過夜，離心0.5 h（2 500 r·min-1），取上清液，調節體積至藥材質量與水體積比1：8，即得質量濃度為125 g·L-1的樣品溶液。
2.2 正交試驗過程
2.2.1 大孔樹脂型號 通過查閱文獻[15]，選擇以下3種大孔吸附樹脂。
Table 1 Properties of macroporous adsorption resin
2.2.2 大孔吸附樹脂的預處理與再生 將3種型號的大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，再用95%乙醇洗至流出液與水1：2混合不產生混濁，改用大量水洗，水浸泡備用。
樹脂使用數次後其吸附效果變差，用0.05 mol·L-1NaOH洗至流出液無色，用蒸餾水洗至中性後用95%乙醇洗至無色，以大量水洗去醇，即可。
2.2.3 總生物堿的純化[15，17] 取預處理好的樹脂適量（相當25 mL水體積）裝柱，將上柱樣品液用1 mol·L-1HCl將pH調至5。精密量取相當5 g生藥量樣品液上柱（流速3 mL·min-1），以蒸餾水清洗雜質（流速6 mL·min-1），再用80%乙醇50 mL洗脫（流速3 mL·min-1）。收集洗脫液，60 ℃水浴蒸幹殘渣以少量水溶解，置分液漏鬥中，並以濃氨水調pH 10～11。用氯仿萃取5次（10，10，10，8，8 mL），收集氯仿液並水浴蒸幹，即得總生物堿。
2.2.4 總生物堿的含量測定 在得到的總生物堿中精密加入濃度為0.01 mol·L-1的硫酸滴定液15.0 mL，水15.0 mL，用0.02 mol·L-1氫氧化鈉滴定液滴定。每1 mL硫酸滴定液[15]（0.01 mol·L-1）相當於12.9 mg烏頭堿（C34H47NO11），用甲基紅，溴甲酚綠指示劑測定總生物堿含量，總生物堿含量=（V空白-VNaOH）×12.9/1 000×W供試品[16]。式中V空白為硫酸滴定液的體積（mL），VNaOH為滴定所用氫氧化鈉的體積（mL），W供試品為鐵棒錘幹燥根的質量（g）。
2.2.5 純化工藝考察 分別以不同樹脂型號、乙醇濃度、乙醇洗脫量作為考察因素，采用3因素3水平對鐵棒錘中總生物堿含量通過正交試驗進行考察，根據試驗結果確定各因素的合理水平。試驗最優方案為A2B3C2，即樹脂型號HPD，722，乙醇濃度80%，洗脫量80 mL條件下，總生物堿的提取含量最高。
2.3 不同產地鐵棒錘總生物堿的含量
在樹脂型號HPD，722，乙醇濃度80%，洗脫量80 mL條件下對4個產地鐵棒錘的總生物堿進行提取，用滴定法測定含量。
3 高效液相色譜法測定烏頭堿含量
3.1 對照品溶液製備