β—catenin蛋白敲除對肺成纖維細胞活性影響的實驗研究
基礎實驗研究
作者：張亞娟 田新瑞 常 琴 王崇剛 董豔婷
[摘要] 目的 探討β-catenin蛋白敲除對TGF-β1誘導的肺成纖維細胞（CCC-REPF-1）活性的影響及其機製。方法 體外培養大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），應用CCK-8法、Western blot、 RT-PCR技術檢測細胞增殖、活性及功能表達，進行統計學檢驗。 結果 TGF-β1刺激組、 pcDNA3轉染組CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn 蛋白表達量、α-SMA 、colⅠ、colⅢmRNA表達量明顯高於正常細胞組，而E-cadherin蛋白表達量明顯低於正常細胞組；F-TrCP-Ecad轉染組上述值明顯低於TGF-β1刺激組（P
[關鍵詞] β-catenin；TGF-β1；肺成纖維細胞；肺纖維化
[中圖分類號] R563.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）21-0001-04
肺纖維化是呼吸係統疾病發展至晚期的共同病理改變，造成肺功能不可逆的損傷，嚴重危害人類健康[1]。目前研究認為，肺纖維化的基本病理過程包括早期彌漫性肺泡炎及後期大量間質細胞增生，發生基質膠原的進行性積聚以致逐漸取代正常的肺組織結構，嚴重影響肺的通氣和換氣功能[2-3]。在增生的細胞中，除肺泡上皮細胞和成肌細胞等外，成纖維細胞的增殖及活化並分泌基質膠原是纖維化形成的重要機製[4]。TGF-β1被認為是誘導肺成纖維細胞活化的最重要的細胞因子[5]，其作用的發揮與β-catenin途徑高度相關[6]。本研究通過觀察β-catenin蛋白敲除對TGF-β1誘導的肺成纖維細胞的增殖及活性的影響，探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機製，為肺纖維化的治療提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及物品
大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），pcDNA3.0載體（Invitrogen），F-TrCP-Ecad載體（鄭國平教授惠贈），Lipofectamine2000（Invitrogen），TGF-β1（PeproTech），抗E-cadherin，抗α -SMA，抗Fn（ SantaCruz），FITC標誌的羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清（中國杭州四季青），高糖DMEM培養基（GIBCO），TRIzol總RNA提取試劑（武漢博士德生物工程有限公司），逆轉錄試劑盒（Promega），實時熒光定量試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），α-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）。
1.2 肺成纖維細胞培養、傳代及分組
在體外培養的大鼠肺成纖維細胞（CCC-REPF-1），用含10%胎牛血清、100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素的高糖DMEM培養基培養於5%的CO2，37℃人工培養箱中，細胞呈貼壁生長，進行傳代培養。細胞分組，分為正常細胞組（A組）、TGF-β1刺激組（B組）、pcDNA3轉染組（C組）、F-TrCP-Ecad轉染組（D組）。
1.3 pcDNA3及F-TrCP-Ecad轉染CCC-REPF-1細胞
提取及純化重組質粒DNA，測DNA 濃度備用。取對數期細胞消化，調整細胞數為2×105 cells/L，接種12孔板中，觀察細胞生長至80%～90%時，棄培液，換無血清無雙抗培養基800 μL，準備轉染。100 μL無雙抗、胎牛血清的培養基中加入4 ng 質粒，混合後置5 min，共6個EP管，3管為質粒pcDNA3，3管為質粒F-TrCP-Ecad，100 μL無雙抗、胎牛血清的培養基中加入 4 μL Lipofectamine2000混合後置 5 min，6個EP管，將上述複合物混合後置20 min，棄12孔板6孔的培養基，用無雙抗、胎牛血清的培養基清洗2次，加無雙抗、胎牛血清的培養基800 μL，將上述複合物分別加入 6個孔，前後晃置4～6 h換正常培養基。轉染6 h換新鮮培養基，各組分別加入TGF-β1（5 ng/mL），作用48 h。
1.4 CCK-8法檢測肺成纖維細胞增殖
將各組細胞調整細胞濃度至5000個/100 μL， 以每孔100 μL接種於96孔板，每組複設8孔，每板每孔加入CCK-8 10 μL，5%CO2孵育箱內繼續孵育1 h，分光光度計下測定450 nm波長處OD值。
1.5 Western 印跡檢測細胞中E-cadherin、α-SMA、Fn的表達
取細胞用PBS洗滌後轉移到EP管，離心後棄上清，將收集到的細胞加細胞裂解液裂解1 h後，離心30 min，取上清，BCA蛋白質定量法測定蛋白濃度，取等量蛋白30 μL行SDS-PVDF凝膠電泳，轉膜至PVDF膜，條件4 ℃ 2～5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h。在4 ℃下小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白單克隆抗體（稀釋為1∶200）與膜接觸孵育過夜，用洗膜緩衝液（TBST）在脫色搖床下洗膜5 min×5次，加羊抗小鼠IgG，室溫下孵育2 h後，TBST洗膜，加入ECL在室溫下反應5 min後成像，Taiphone掃描結果，采用Gene Snap/Gene Tool軟件分析以GAPDH蛋白為內參定量分析E鈣黏蛋白、α-SMA、纖維連接蛋白條帶相對灰度值。
1.6 總RNA 抽提及實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（Real-timePCR）
各組細胞每孔加入500 μL TRIzol Reagent，按試劑盒說明提取總RNA及行RT-PCR檢測α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表達，GAPDH為內參。